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4. Discussion

4. 1. Signification du marquage obtenu en immunohistochimie.

4. 2. Rôle potentiel de l'actine bêta, de la L-caldesmone et de la calponine acide dans la plasticité des cellules nerveuses.

4. 2. 1 Enrichissement dans les cônes de croissance

4. 2. 2 Enrichissement dans les épines dendritiques et les densités postsynaptiques.

4. 2. 3 Enrichissement dans les cortex cellulaires et les régions sous membranaires.

4. 3 Rôle potentiel de l'actine bêta et de la calponine acide dans la plasticité des cellules gliales.

4. 3. 1 Enrichissement de l'actine bêta dans la microglie

4. 3. 2 Enrichissement de la calponine acide dans l'astroglie

 

Ce travail a permis d'apporter des données nouvelles sur la présence, la distribution et la localisation de l'actine bêta, de la L-caldesmone et de la calponine acide pendant le développement postnatal du système nerveux central, à l'âge adulte et après lésion épileptique. Parmi les résultats les plus significatifs, nous avons montré que l'immunoréactivité de l'actine bêta était particulièrement enrichie dans la microglie-macrophage et qu'elle était associée aux changements morphologiques que subissaient ces cellules pendant le développement postnatal, retraçant l'invasion des macrophages et leur différenciation en microglie dans les différentes régions du SNC, ainsi qu'après injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique lors de la réaction microgliale. Nous avons aussi montré que la L-caldesmone et la calponine acide étaient présentes in vivo dans les neurones matures où elles étaient localisées exclusivement au niveau postsynaptique et particulièrement bien concentrées dans les épines dendritiques et les densités postsynaptiques. De plus, la L-caldesmone et la calponine acide étaient plutôt adjacentes et non superposées dans les mêmes régions somatodendritiques. Nous avons montré que la calponine acide était également présente dans les cellules astrogliales in vivo, alors que pour la caldesmone aucune immunoréactivité n'a pu être décelée in vivo dans les cellules gliales bien qu'elle fût identifiée dans les astrocytes en culture (Abd-El-Basset et al., 1991). Nous avons aussi montré que l'expression de ces protéines était régulée de façon spatio-temporelle pendant le développement postnatal de l'encéphale mais que leur distribution n'était pas la même suivant les structures et les types cellulaires considérés. Ainsi, dans les premiers jours qui suivent la naissance, les cellules nerveuses du cortex, de l'hippocampe (cellules pyramidales) et du cervelet (cellules de Purkinje et cellules granulaires internes) sont très bien marquées par les anticorps anti-caldesmone alors que seules les cellules granulaires du cervelet sont marquées par les anticorps anti-calponine à ce stade du développement. Ce n'est qu'à partir de P10, soit dix jours après la naissance, que l'on peut voir apparaître la calponine acide de façon significative dans les autres types de cellules nerveuses. De surcroît, les cellules les plus intensément marquées par l'anticorps anti-calponine acide pendant le développement sont surtout les cellules astrogliales (glie radiale, glie de Bergmann, glie limitans et astrocytes), tandis que ces mêmes cellules ne sont pas marquées par les autres anticorps anti-calponine et anti-caldesmone utilisés. Nous avons également montré que, comme pour la L-caldesmone (Kira et al., 1995), la calponine acide était particulièrement enrichie dans les extrémités croissantes des neurones et des astrocytes en culture et qu'elle se concentrait surtout dans le cur des cônes de croissance et dans les lamellipodes, alors que les filopodes étaient en général peu ou pas immunoréactifs. Nous avons montré que la calponine acide était présente dans les cortex cellulaires et les fibres de stress des astrocytes et des fibroblastes en culture, ainsi que dans le soma des cellules microgliales en culture mais qu'elle était absente des protrusions et des prolongements microgliaux. Nous avons aussi mis en évidence dans les cultures enrichies en astrocytes et portée à confluence une population astrogliale (GFAP et vimentine positive) avec un soma de petite taille munie de fins prolongements stellaires qui était totalement dépourvue de calponine acide. Enfin, nous avons montré qu'après injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique, l'immunoréactivité de la L-caldesmone et de la calponine acide augmentait dans les neurones dégénératifs de l'hippocampe et de l'amygdale avant de disparaître dans les régions sclérosées et de persister dans les cellules nerveuses qui ont survécues. De plus, nous avons montré que l'intensité de l'immunoréactivité de l'anticorps anti-calponine acide était très étroitement associée à la réaction astrogliale dans la région CA3 et le hilus de l'hippocampe. Néanmoins, aucune modification importante n'a été révélée dans les régions de bourgeonnement axonal.

Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent fortement que ces protéines puissent intervenir dans les remaniements morphologiques associés aux différentes formes de plasticités du SNC. Quelques points sur la signification des résultats obtenus vont ainsi être abordés dans les chapitres suivants.

En tenant compte des données issues de ce présent travail et des données publiées à ce jour sur l'actine bêta, la L-caldesmone et la calponine acide dans le SNC (Abd-El-Basset et al., 1991 ; Kira et al., 1995 ; Trabelsi-Terzidis et al., 1995 ; Represa et al., 1995 ; Fehrat et al., 1996 ; Ulloa et Avila, 1996 ; Weinberger et al., 1996 ; Kaech et al., 1997 ; Bassel et al., 1998 ; Plantier et al., 1998 ; Gunning et al., 1998 ; Micheva et al., 1998 ; Plantier et al., 1999), nous pouvons désormais affirmer que ces trois protéines sont spécialement enrichies dans la périphérie et les extrémités des cellules nerveuses dans les domaines où se concentrent les microfilaments telles que les cônes de croissance, les épines dendritiques et les cortex cellulaires (voir ci-dessous ch. 4.2).

Dans les cellules gliales, la distribution et la localisation de ces trois protéines semblent comporter quelques différences notables (ch. 4.1 et 4.3). A la différence de l'actine bêta qui est particulièrement enrichie dans les cellules microgliales, la L-caldesmone et la calponine acide sont absentes des protrusions gliales et des fins prolongements microgliaux. Néanmoins, dans l'ensemble, la présence de ces protéines est conciliable avec une localisation microfilamentaire (fibres de stress, cortex cellulaires). Il est également intéressant de noter que la présence et la localisation de la calponine acide dans les cellules astrogliales évolue différemment en fonction de leur état de maturation. De plus, la calponine acide colocalise fréquemment avec les gliofilaments dans les cellules astrogliales immatures et beaucoup plus rarement dans les astrocytes matures.

4. 1 Signification du marquage obtenu en immunohistochimie.

Nous avons montré que les anticorps anti-caldesmone utilisés lors de ce travail ne marquaient pas " in vivo " les cellules gliales (astrocytes, oligodendrocytes et microglie), alors que " in vitro " Abd-El-Basset et collaborateurs avaient montré que la caldesmone était présente le long des fibres de stress dans des cultures de colonies d'astrocytes en différenciation et que la protéine colocalisait très bien avec la myosine et la tropomyosine (Abd-El-Basset et al., 1991). D'autre part, alors que tous les anticorps anti-calponine utilisés lors de ce travail marquaient les astrocytes en culture, seuls les anticorps spécifiquement dirigés contre la calponine acide de rat marquaient les cellules astrogliales " in vivo ". Comment expliquer ces différences ?

L'efficacité qu'ont les anticorps pour détecter la protéine recherchée dans les différentes cellules du SNC peut être limitée par l'origine de l'antigène utilisé pour leur fabrication (c'est à dire l'animal i.e. rat, cochon, lapin, poulet etc., l'organe ou le tissu i.e. muscle lisse, plaquettes, cerveau etc., ou l'isoforme protéique i.e. calponine basique, calponine acide, etc.). Dans le cadre de nos expériences, la spécificité de réaction des différents anticorps a été testée par immunoblotting après séparation des protéines par SDS-PAGE montrant dans chaque cas une affinité exclusive pour la protéine considérée. Néanmoins, cette affinité (constante d'association de l'anticorps pour l'antigène) n'a pas été précisément déterminée.

Les cellules en culture peuvent également exprimer des protéines que les cellules " in vivo " n'exprimeraient pas ou l'inverse, car le contexte environnemental est très différent. Il est également possible d'avoir des cellules marquées qui n'expriment pas la protéine (marquage non spécifique). Cependant, toutes les expériences immunochimiques ont été réalisées en même temps que des contrôles où l'anticorps primaire a été omis. De plus, afin de saturer tous les sites non spécifiques, les coupes et les cultures ont été préincubées en présence de protéines (sérumalbumine, gélatine etc.) n'ayant aucune affinité de réaction avec l'anticorps primaire utilisé. L'immunohistochimie et l'immunocytochimie ne sont que des techniques qualitatives qui permettent de mettre en évidence au niveau tissulaire et cellulaire certaines molécules antigéniques. Ainsi, nous ne pouvons pas conclure sur l'expression gliale de la caldesmone, mais par contre il est clair que la glie exprime la calponine, aussi bien in vivo qu'in vitro, ce que notre groupe de recherche avait déjà suggéré (Ferhat et al., 1996) par hybridation in situ. Quant à la nature du marquage neuronal pour la caldesmone et la calponine, nos résultats montrent une très bonne concordance. Il est à noter que les méthodes de révélation de l'immunoréactivité ont également leurs limites et leurs inconvénients. Ainsi, avec les techniques enzymatiques (par ex : utilisation de la peroxydase en présence de diaminobenzidine DAB et d'eau oxygénée H2O2), le produit coloré de la réaction (la DAB oxydée) peut diffuser plus ou moins loin et marquer des régions qui seraient dépourvus de la protéine avant que la réaction enzymatique ne soit arrêtée. Néanmoins, l'analyse du marquage permet quand même d'exclure certaines régions. Ainsi, en microscopie électronique, et malgré une diffusion possible de la DAB, l'absence de marquage dans les régions présynaptiques est justifiée parceque la DAB ne peut pas diffuser à travers la membrane plasmique.

4. 2. Rôle potentiel de l'actine bêta, de la L-caldesmone et de la calponine acide dans la plasticité des cellules nerveuses.

4. 2. 1 Enrichissement dans les cônes de croissance

Le cône de croissance est une structure complexe située à l'extrémité des prolongements d'une cellule nerveuse en voie de différenciation. Dans les cônes de croissance des cellules nerveuses en culture, on distingue une région centrale (le cur) qui est plus ou moins étalée et une région périphérique très mobile qui est constituée d'une zone boursouflée : le lamellipode (lamellae), et de nombreuses protrusions plus ou moins longues : les filopodes (filopodia) (pour un schéma, voir introduction : figure 1f). Le cur du cône contient des mitochondries, du reticulum endoplasmique, des ribosomes et des microtubules alors que sa périphérie en est généralement dépourvue. La fonction d'un cône de croissance est de guider le neurite pendant son développement ; les filopodes y joue alors le rôle d'antennes sensibles (Davenport et al., 1993 ; Kater et al., 1994) et permettent de détecter dans l'environnement du cône les différentes molécules chemoattractives ou chemorépulsives (netrines, semaphorines, etc.) ainsi que les différentes molécules de contact (protéines de la matrice extracellulaire ECMs, protéines d'adhésion IgCAMs, cadhérines, ligands Eph, etc.) du substrat dans lequel ils évoluent (pour une revue lire Tessier-Lavigne & Goodman, 1996). Les filopodes possèdent également des propriétés motrices importantes et sont capables de croître et de se rétracter assez rapidement (Rehder & Kater, 1996). L'actine est l'un des composants cytosquelettiques majeurs présent à la lisière du cône de croissance (lamellipodes et filopodes). L'organisation du réseau d'actine dans les cônes de croissance a été particulièrement bien décrite (Lewis & Bridgman, 1992). Dans les filopodes, on trouve des faisceaux de filaments d'actine (bundles), de 40 à 100 nm de long, en étroite association avec la membrane ventrale par le biais de protéines d'association. Ces filaments sont orientés et sont présents sur toute la longueur du filopodes ; ils se disposent de façon radiale par rapport à la lisière du cône et pénètrent plus ou moins profondément dans la structure lamellipodiale. Dans le lamellipode, une autre population de filaments d'actine, plus courts, ramifiés et réticulés, remplie le volume existant entre la surface des membranes dorsale et ventrale du lamellipode. De nombreuses études ont montré que l'émergence des neurites et la motilité des cônes de croissance dépendaient en grande partie de la dynamique des filaments d'actine. L'adjonction de cytochalasine (facteur dépolymérisant de l'actine ; Cooper, 1987) induit, dans les minutes qui suivent le traitement, l'émergence d'une structure lamellipodiale dans les neuroblastes indifférenciés (Lafont et al., 1993) et aboutit à une rétraction et une disparition des filopodes dans les cônes de croissance (Forscher & Smith, 1988)., Un flux rétrograde des filaments d'actine (3 à 6 mm/min) qui est inversement proportionnel à l'avancée du cône de croissance, a ainsi été mis en évidence dans les filopodes (Lin & Forscher, 1995). La quantité relative et la localisation des deux isoformes d'actine (b et g) varient pendant la différenciation des neuroblastes en culture. La proportion d'actine gamma tend à augmenter et à exister sous forme polymérisée alors que la proportion d'actine bêta tend à diminuer et à exister sous forme dépolymérisée (Ulloa & Avila, 1996). De plus, l'actine bêta est prédominante dans les filopodes (Kaech et al., 1997 ; Bassel et al., 1998). La stabilisation des filaments d'actine est donc un facteur déterminant dans la dynamique des filopodes, dans la croissance des neurites et dans la différenciation d'une cellule nerveuse. La présence et la localisation de plusieurs isoformes différentes de myosine (I, II et V) dans les cônes de croissance ont également été montrées (Bridgman & Dailey, 1989 ; Hasson & Mooseker, 1997). Plusieurs données ont émergées sur le rôle fonctionnel du système actomyosine dans les extrémités croissantes (Suter & Forscher, 1998). Ainsi récemment, Lin et collaborateurs ont démontré que des inhibiteurs de l'actomyosine atténuaient le flux rétrograde de l'actine-F dans les cônes neuronaux d'une manière dose dépendante (Lin et al., 1996). De plus, en utilisant une technique récente qui permet d'inactiver une protéine par un pulse de lumière (CALI), Wang et al. ont montré que l'inactivation de la myosine V induisait une cessation de l'extension des filopodes tandis que l'inactivation de la myosine I aboutissait à une extension des lamellipodes (Wang et al., 1996).

Le calcium jouant un rôle important dans la régulation de la croissance du cône et des filopodes (Lankford & Letourneau, 1989 ; Kater & Smith, 1991 ; Rehder & Kater, 1992 ; Bandtlow et al., 1993), la sensibilité au calcium du réseau microfilamentaire et de l'activité actomyosine serait essentiellement liée à des protéines se fixant à l'actine qui interagiraient directement ou indirectement avec le calcium (Letourneau et al., 1994). De telles protéines ont été identifiées dans les cônes de croissance : on trouve la calmoduline (Letourneau & Shattuck, 1989), la calcineurine (Ferreira et al., 1993), l'alpha-actinine et la fodrine (Sobue & Kanda, 1989), la gelsoline (Tanaka et al., 1993), l'ADF (Bamburg & Bray, 1987), la vinculine (Arregui et al., 1994), la fascine et la drebrine (Sasaki et al., 1996). La présence de la L-caldesmone (Kira et al., 1995) et de la calponine acide (ce travail ; résultats : fig. 20) dans les cônes de croissance et d'une manière générale dans les extrémités croissantes suggère que ces protéines puissent intervenir dans la modulation de la taille et de la longueur des filopodes et contribuer ainsi au guidage des neurites en croissance (fig.28). La L-caldesmone montre une distribution concomitante mais pas totale avec l'actine-F, la myosine II et la tropomyosine dans les cône de croissance. Néanmoins, bien que la L-caldesmone et la calponine acide colocalisent fortement avec les filaments d'actine marquées dans la majeur partie du cône de croissance, certains filaments d'actine présents dans les filopodes et plus précisément dans leur extrémité en sont dépourvus. Ainsi, leur capacité à stabiliser les filaments d'actine et à inhiber l'activité actomyosine permettrait l'accroissement des filopodes. Enfin, les mécanismes qui ont été présentement décrit pour les cônes de croissance des cellules nerveuses vaudraient vraisemblablement aussi pour les cônes de croissance des cellules gliales où nous avons mis en évidence une localisation de la calponine acide dans le cur du cône et dans les lamellipodes mais également dans les domaines gliofilamentaires (vimentine et GFAP). La figure 28 résume schématiquement la localisation de l'actine bêta, de la L-caldesmone et de la calponine acide dans les cônes de croissance et illustre l'implication potentielle de ces protéines dans les remaniements morphologiques.

4. 2. 2 Enrichissement dans les épines dendritiques et les densités postsynaptiques.

Les épines dendritiques sont des excroissances présentes en général le long des dendrites d'un grand nombre de cellules nerveuses matures (cellules pyramidales, cellules de Purkinje, etc.). Elles représentent des sites postsynaptiques majeurs permettant un contact privilégié avec les terminaisons axonales. D'ailleurs, dans le cerveau des vertébrés, la majorité des contacts synaptiques a lieu sur des épines dendritiques. Les épines sont constituées d'une tête, de forme et de taille variable, et d'une tige relativement étroite reliant la tête de l'épine au dendrite. En microscopie électronique, l'ultrastructure des épines permet de définir plusieurs traits morphologiques constants : une absence de mitochondries, un appareil épineux situé à la base de l'épine qui est constitué d'un empilement de sacs membranaires comparables à ceux du réticulum endoplasmique lisse, et une région relativement large et dense aux électrons : la densité postsynaptique. Tous les contacts synaptiques avec des épines sont asymétriques (synapse excitatrice), avec du côté présynaptique une population homogène de vésicules rondes et claires (pour un schéma voir introduction fig. 1g). Les épines dendritiques représentent également les domaines des cellules nerveuses qui possèdent la plus forte concentration d'actine filamentaire (Fifkova and Delay, 1982 ; Matus et al., 1982). L'actine est organisée en un réseau compact qui épouse la forme particulière de l'épine. Dans la tête de l'épine, les filaments ne sont pas orientés (lattice) et sont en contact avec la membrane plasmique et la densité postsynaptique par le biais de sites d'ancrage et de réticulation ; dans la tige de l'épine, les filaments forment un faisceau orienté de façon parallèle tout le long de l'axe principal et sont en contact avec les membranes de l'appareil épineux. L'évolution architecturale de ce réseau d'actine permettrait d'expliquer les propriétés plastiques que possèdent les épines dendritiques. En effet, de nombreux travaux ont montré que divers stimuli augmentant l'activité électrique des cellules nerveuses étaient accompagnés par des changements morphométriques importants de leurs épines ainsi que d'une réorganisation du réseau microfilamentaire (pour une revue lire Fifkova and Morales, 1992). Une étude récente sur les épines dendritiques de neurones hippocampiques en culture marquées par de l'actine fluorescente (actine-GFP) a montré que ces changements étaient relativement rapides et dépendaient de l'état de polymérisation de l'actine, l'adjonction de cytochalasine (agent dépolymérisant de l'actine-F) bloquant le mouvement spontané des épines (Fischer et al., 1998). Dans les épines dendritiques, le réseau d'actine-F est relativement stable et comporte un pool de filaments qui est seulement en partie sensible à l'action de la cytochalasine D ; seul un traitement avec la latrunculine A permet de dépolymériser totalement le réseau d'actine-F et aboutit à une diminution du nombre d'épines, suggérant un rôle central pour l'actine filamentaire dans le maintien de la forme et de l'existence même des épines dendritiques (Allison et al., 1998). Il a également été montré que de nombreuses modifications morphologiques des épines ont été observées en association avec un mécanisme de potentialisation à long terme (LTP) qui à ce jour représente un modèle de plasticité synaptique très intéressant (Fifkova & Van Harreveld, 1977 ; Fifkova & Anderson, 1981 ; Desmond & Levy, 1983 ; Geinisman et al., 1991, 1992 ; Buchs & Muller, 1996). Or, la dépolarisation membranaire induite après activation répétée des synapses et l'augmentation conséquente d'une entrée de calcium libre dans les épines via des récepteurs NMDA ou des canaux calciques voltage dépendant, sont des facteurs nécessaires afin de permettre une potentialisation de la transmission synaptique (Kauer et al., 1988 ; Malenka et al., 1988 ; Muller & Connor, 1991). Dans les épines dendritiques, la densité du réseau microfilamentaire est inversement proportionnelle à la concentration en calcium libre cytoplasmique. L'augmentation locale de la concentration en ions calcium dans les épines dendritiques après des stimulations répétées causerait ainsi une fragmentation sélective de certains filaments d'actine particulièrement sensible à l'action de protéines de fragmentation et de séquestration qui sont calcium-dépendantes (telle que la gelsoline par exemple), et permettrait les remaniements observés (Fifkova & Morales, 1992). L'influence du calcium, d'une manière générale, sur l'organisation de l'actine est essentiellement dû à des protéines se liant à l'actine qui sont directement ou indirectement sensible au calcium. De telles protéines ont été identifiées dans les épines dendritiques : on trouve la fodrine ou spectrine cérébrale (Carlin et al., 1983), MAP-2 (Caceres et al., 1984), la myosine (Morales and Fifkova, 1989), l'adducine (seidel et al., 1995), la drebrine (Hayashi et al., 1996) et l'alpha-actinine (Wyszynski et al., 1997). Dans ce travail, nous avons montré que la L-caldesmone et la calponine acide étaient présentes dans les épines dendritiques (résultats : fig. 7b,c et fig. 13c). En tenant compte de leurs différentes propriétés physico-chimiques démontrées in vitro, ces deux protéines pourraient contribuer à l'édification et à la stabilisation du réseau microfilamentaire dans les épines dendritiques (fig.29). La myosine étant également présente dans les épines dendritiques, l'activation de l'actomyosine pourrait rendre compte des changements morphologiques observés. L'élévation de la concentration en calcium, via la calmoduline, activerait la MLCK, laquelle phosphorylerait la chaîne légère de la myosine (MLC) et rendrait possible les interactions actine-myosine. L'inhibition de l'activité ATPasique de l'actomyosine par la L-caldesmone et la calponine acide empêcheraient ces remaniements. La L-caldesmone et la calponine acide sont aussi présentes au niveau des densités postsynaptiques (PSD). Les densités postsynaptiques représentent des spécialisations fibreuses sousmembranaires des synapses qui en microscopie électronique apparaissent denses aux électrons et qui sont résistantes à l'action des détergents (Kennedy, 1993, 1997). C'est au niveau des densités postsynaptiques que se concentrent les récepteurs glutamatergiques : récepteurs NMDA, AMPA et métabotropiques (Ottersen & Landsend, 1997). De nombreux travaux tendent à montrer que l'actine filamentaire jouerait un rôle important dans la régulation de l'ancrage et de l'activité des récepteurs membranaires (Allison et al., 1998). Ainsi, il a été montré que l'état de fonctionnement des récepteurs NMDA était régulé par l'état de polymérisation des filaments d'actine (mécanosensibilité) de façon calcium dépendante (Rosenmund & Westbrook, 1993). La L-caldesmone et la calponine acide pourraient, en consolidant les filaments d'actine, intervenir dans le maintien des récepteurs au niveau de la synapse dans un état fonctionnel. La figure 29 résume schématiquement la localisation de l'actine bêta, de la L-caldesmone et de la calponine acide dans les épines dendritiques et illustre l'implication potentielle de ces protéines dans les remaniements morphologiques.

4. 2. 3 Enrichissement dans les cortex cellulaires et les régions sous membranaires.

Les cortex cellulaires et les régions sous membranaires représentent la périphérie des cellules et déterminent avec la membrane plasmique les limites morphologiques des cellules. L'organisation de ces régions est très variable d'une cellule à l'autre et plusieurs structures macromoléculaires ont pu ainsi être caractérisées. On trouve ainsi dans les cellules nerveuses et les cellules gliales, des zones d'attachement ou jonctions cellulaires, des sites d'adhésion focale (ou l'on trouve de la vinculine et des cadhérines), des zones de contacts synaptiques (synapses électriques et synapses chimiques, PSD), etc. Un des points communs à toutes ces régions est qu'elles sont particulièrement riches en actine filamentaire. La stabilisation des filaments d'actine au niveau de ces sites est nécessaire pour que de nombreuses fonctions physiologiques aient lieu. L'actine bêta, la l-caldesmone et la calponine acide sont particulièrement enrichies dans ces régions corticales sous membranaires (voir résultats : fig. 2d ; fig. 5e ; fig. 7 ; fig. 11e ; fig. 13 ; fig. 20, 21, 22 et 23). De plus, des expériences in vitro ont montré que la caldesmone et la calponine pouvaient interagir avec certains phospholipides (Vorotnikov et al., 1992 ; CzuryLo et al., 1993 ; Fujii et al., 1995) suggérant un contact étroit avec la membrane plasmique. L'ensemble de ces données suggère que ces protéines puissent jouer un rôle structural important dans la morphologie des cellules et dans la tension cellulaire exercée par le cytosquelette microfilamentaire sur la membrane plasmique.

4. 3 Rôle potentiel de l'actine bêta et de la calponine acide dans la plasticité des cellules gliales.

4. 3. 1 Enrichissement de l'actine bêta dans la microglie

La microglie représente dans le système nerveux central toutes les cellules non neuronales, de petites tailles qui possèdent de fins prolongements ramifiés; ce sont des macrophages cérébraux quiescents et résidents qui sont activés en cas d'événements pathologiques et jouent un rôle important dans la réaction inflammatoire. La dynamique des filaments d'actine dans les cellules microgliales activées représente un événement majeur dans les remaniements morphologiques observés et dans les processus de phagocytoses (Abd-El-Basset et Fedoroff, 1994). Lors de ce travail, nous avons montré que l'immunoréactivité de l'actine bêta était particulièrement enrichie dans les cellules microgliales et dans les macrophages cérébraux (résultats : fig. 1a et fig. 4c,d). De plus, les changements concernant l'immunoréactivité de l'actine bêta étaient dans tous les cas de figure étroitement associés aux remaniements morphologiques et aux transformations que subissaient ces cellules (résultats : fig. 2b, fig. 3b,d,f). Ainsi, pendant la maturation cérébrale, les cellules macrophagiques qui envahissent le cerveau, développent de fins prolongements hautement ramifiés, caractéristiques de la microglie résidente, tandis qu'après lésions les cellules microgliales perdent ces prolongements et retrouvent l'aspect morphologique des cellules macrophagiques spécialisées dans les processus immuns et dans les mécanismes de phagocytoses. Les cellules les plus intensément marquées par l'anticorps anti-actine bêta sont des cellules larges, rondes, amiboïdes et en général dépourvues de prolongements. Or, il a été montré que la surexpression de l'isoforme b de l'actine (à l'inverse de l'isoforme g) dans des myoblastes transfectés induisait une augmentation de la surface cellulaire et était accompagnée de changements dans l'organisation des microfilaments (Schevzov et al., 1992). La plupart des études réalisées sur la fonction de l'actine bêta montrent qu'elle est fortement impliquée dans la régulation de la morphologie et de la motilité des cellules (Hoock et al., 1991 ; Schevzov et al., 1992 ; Kislauskis et al., 1994 ; von Arx et al., 1995 ; Mounier et al., 1997). Hoock et collaborateurs ont montré que l'actine bêta était localisée dans les régions de remodelage cytoplasmique des cellules (Hoock et al., 1991). En plus, il a été montré que l'actine b était spécifiquement impliquée dans l'étalement des cellules, mais également dans l'émergence et le maintien des structures lamellipodiales (Kislauskis et al., 1994). L'actine bêta jouerait ainsi un rôle déterminant dans la différenciation cellulaire, le remodelage membranaire et l'organisation cytoarchitecturale ainsi que pendant la migration des cellules.

Toutes ces observations suggèrent par conséquent que l'actine bêta puisse jouer un rôle déterminant dans les modifications morphologiques des cellules de la microglie-macrophage à la fois pendant le développement (migration cellulaire, différenciation morphologique) et après lésions (Gonflement des prolongements, rétraction et disparition des ramifications, phagocytoses et déformations membranaires, réacquisition des prolongements).

4. 3. 2 Enrichissement de la calponine acide dans l'astroglie

La fabrication et l'utilisation d'un anticorps polyclonal spécifiquement dirigé contre la calponine acide nous a permis de mettre en évidence une distribution beaucoup plus large de la protéine in vivo et notamment un enrichissement dans les cellules astrogliales. En étudiant plus particulièrement l'expression et la localisation de la calponine acide dans les cellules astrogliales au sein d'une structure privilégiée telle que l'hippocampe, nous avons pu néanmoins mettre en évidence différentes populations cellulaires. En premier lieu, il faut noter que toutes les cellules astrogliales n'expriment pas la calponine acide. Ceci a été montré en microscopie électronique dans l'hippocampe mature in vivo (fig. 13d) ainsi que dans les cultures cellulaires d'hippocampe P2 enrichies en astrocytes, portées à confluence et doublement marquées avec la vimentine ou la GFAP (fig. 22c et e). De plus, nous avons montré que l'expression de la calponine acide dans l'hippocampe était régulée de façon spatio-temporelle avec des différences significatives suivant les types cellulaires et les régions subcellulaires concernées. Pendant le développement postnatal de l'hippocampe, les cellules de la glie radiale de la corne d'Ammon qui sont très intensément marquées, se transforment en astrocytes autour de P10 au même moment ou l'isoforme la plus acide de la calponine n'est plus exprimée (fig. 14, fig. 17). Dans les astrocytes en culture, nous avons remarqué que la calponine acide était exprimée faiblement dans les cellules non ou peu différenciées, puis fortement dans les prolongements en croissance où la calponine colocalisait avec la GFAP et la Vimentine (fig. 21), et enfin modérément dans les astrocytes matures le long des fibres de stress (fig. 22). Nous avons également pu distinguer au moins trois populations astrogliales différentes dans l'hippocampe ipsilatéral des rats traités au KA : les astrocytes réactifs du hilus et de CA3 qui sont très intensément immunoréactifs pour la GFAP et calponine acide, les astrocytes réactifs hypertrophiés de la couche moléculaire du gyrus denté qui sont très intensément immunoréactifs pour la GFAP mais qui ne sont que modérément marquées par les anticorps anti-calponine acide et les astrocytes non réactifs des autres couches de l'hippocampe (fig. 25 et fig. 26). L'ensemble de ces données montre que la calponine acide est différemment exprimée suivant l'état de différenciation de la cellule astrogliale et suivant son état d'activation et suggère par conséquent que la calponine acide puisse jouer un rôle important en consolidant les filaments d'actine lors de la différenciation des cellules gliales et contrôler la dynamique des filaments d'actine lors des différents événements plastiques que subissent les cellules astrogliales. Enfin, l'absence de calponine dans un certain nombre de cellules astrogliales pourrait refléter un état particulièrement avancé de maturation ou de dégénérescence cellulaire ou bien un état dynamique très important comme dans le cas de cellules entrant en division. En effet, alors que la teneur en filaments intermédiaires de GFAP s'intensifie au cours de la maturation gliale et devient prédominante dans l'astroglie vieillissante (" small stellate astrocytes "), la teneur en actine filamentaire et en protéines se liant à l'actine telle que la caldesmone s'amenuise, aboutissant à un état de non motilité (Abd-El-Basset et al., 1991).

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