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2. Données bibliographiques

2. 1 Microfilaments et activité actomyosine

2. 1. 1 Composition des microfilaments

2. 1. 2 Régulation de l'activité actomyosine

2. 2 L'actine

2. 2. 1 Généralité sur l'actine

2. 2. 2 Actine bêta

2. 2. 3 Protéines associées à l'actine

2. 3 La caldesmone

2. 3. 1 Généralité sur la caldesmone

2. 3. 2 L-caldesmone

2. 4 La calponine

2. 4. 1 Généralité sur la calponine

2. 4. 2 Calponine acide (h3)

2. 5 Relation, similarités et différences entre la caldesmone et la calponine

 

2. 1 Microfilaments et activité actomyosine (revenir à 2. Données bibliographiques)

Les microfilaments sont ubiquitaires et par conséquent se retrouvent dans tous les types cellulaires, y compris les cellules nerveuses. Ils supportent de nombreuses activités motiles des cellules eucaryotes, comme par exemple : la séparation des cellules filles lors de la division cellulaire (Sanger & Sanger, 1976 ; Schroeder, 1976), le déplacement des cellules lors des migrations embryogéniques et physiopathologiques (Mitchison & Cramer, 1996) ou bien les phénomènes d'endocytose et d'exocytose qui permettent, entre autres, aux macrophages d'avaler leurs proies (Allen & Aderem, 1996) et aux terminaisons synaptiques de libérer leurs neurotransmetteurs (Bernstein & Bamburg, 1989). Bien que leur composition soit différente suivant les cellules (et même suivant les différents compartiments qui les composent), l'actine en est la protéine essentielle (voir ci-dessous, chapitre 2. 2). Elle possède la propriété de se polymériser et de se dépolymériser rapidement, formant des filaments de longueurs variables et créant un équilibre dynamique entre la forme filamenteuse (actine-F polymérique) et la forme globulaire (actine-G monomérique). La polymérisation de l'actine est ainsi un facteur déterminant dans la motilité cellulaire (Cooper, 1991). L'actine est également capable d'interagir avec de nombreuses protéines (plus d'une cinquantaine ont été répertoriées jusqu'à présent) et en particulier avec la myosine. Dans ce cas, l'actine-F a la propriété de stimuler l'activité ATPasique de la myosine et de servir de support au pivotement des têtes de myosines - mécanisme fondamental qui est à la base de la contraction cellulaire. Les microfilaments ont ainsi été particulièrement bien étudiés dans la contraction des muscles striés (squelettiques et cardiaques) où ils forment avec les filaments épais de myosine des structures ordonnées quasi-cristallines (Huxley, 1963), mais également dans les muscles lisses (vaisseaux sanguins, trachée, bronches, larynx, estomac, intestin, sphincters, vessie, utérus, etc.), bien que l'organisation du système microfilamentaire et son association avec la myosine forment un ensemble beaucoup plus hétérogène et rendent plus difficile son étude (Dabrowska, 1994 ; Small, 1995). Dans les systèmes non-musculaires, la variété et la diversité des fonctions qui incombent à la dynamique des microfilaments ainsi qu'à l'activité contractile de la myosine rendent l'approche encore plus difficile. Cependant un grand nombre de travaux semblent indiquer que les mécanismes impliqués seraient assez proches de ceux qui ont été décrits dans le muscle lisse (Adelstein, 1982).

Dans le système nerveux, l'actine et la myosine ont été identifiées aussi bien dans les cellules nerveuses que dans les cellules gliales (Puszkin & Berl, 1972 ; Chang & Goldman, 1973 ; Burridge & Bray, 1975). Certaines données montrent que les mécanismes d'assemblage de l'actine en filament et de translation des filaments d'actine grâce à la myosine existent et sont impliqués dans divers processus plastiques du système nerveux. Des études ex vivo ont ainsi montré en particulier que l'actine et la myosine pouvaient contribuer à l'émergence des prolongements (Baorto et al., 1992 ; Lafont et al., 1993 ; Padmanabhan & Shelanski, 1998) ainsi qu'à la motilité et au guidage des cônes de croissance (Wang et al., 1996 ; Lin et al., 1996). Un travail récent de Fischer et collaborateur en 1998, montre que l'actine est également déterminante dans la morphologie et la plasticité des épines dendritiques des neurones en culture (Fischer et al., 1998).

De plus, des études ultrastructurales in vivo montrant que ces deux protéines étaient enrichies dans les épines dendritiques et au niveau des densités postsynaptiques ont suggéré que l'actine et la myosine puissent contribuer et participer aux remaniements morphologiques impliqués lors de la plasticité synaptique (Fifkova & Delay, 1982 ; Matus et al., 1982 ; Cohen et al., 1985 ; Morales & Fifkova, 1989 ; Miller et al., 1992 ; Fifkova & Morales, 1992 ; Harris & Kater, 1994). De surcroît, les microfilaments sont également impliqués dans l'ancrage de nombreuses protéines membranaires (Bennett & Gilligan, 1993 ; Carbonetto & Lindenbaum, 1995) et peuvent moduler l'activité des récepteurs membranaires tel que le récepteur-canal NMDA (Rosenmund & Westbrook, 1993 ; Allison et al., 1998) ou des canaux voltage-dépendant (Maguire et al., 1998) et contribuer à modifier ainsi l'efficacité de la transmission synaptique.

Enfin, bien que les microfilaments soient impliqués dans les processus d'exocytoses des cellules gliales et neuronales, et notamment dans la libération des neurotransmetteurs (Bernstein & Bamburg, 1989), la contribution de l'actomyosine, quant à elle, est sujette à controverse (Miller et al., 1992 ; Mochida et al.,1994 ; Prekeris & Terrian, 1997). Il est à noter que la composition moléculaire et l'organisation du système microfilamentaire sont différents de part et d'autre de la synapse. Comme nous venons de le voir, les microfilaments et le système actomyosine participent ainsi à un panel important de fonctions physiologiques des cellules nerveuses et gliales. Néanmoins, de nombreuses questions restent encore en suspens quant à la composition des microfilaments ainsi qu'aux mécanismes de régulation de l'actomyosine dans les différentes populations cellulaires du SNC.

 

Composition des microfilaments et régulation de l'activité actomyosine

2. 1. 1 Composition des microfilaments. (revenir à 2. Données bibliographiques)

Les microfilaments se composent de plusieurs isoformes d'actine, de tropomyosine et de protéines associées (fig. 3 et fig.4). Suivant les tissus, les types cellulaires et les compartiments subcellulaires, ces différentes protéines et leurs isoformes ne sont pas pareillement exprimées ni distribuées de la même façon (Herman, 1993 ; Gunning et al., 1998). Ces données montrent que les fonctions ou les mécanismes de régulation de l'expression de ces isoformes sont différents et que leur impact sur la physiologie et la morphologie cellulaire est important.

Ainsi, seulement deux isoformes beta et gamma ou b et g (dites cytoplasmiques) de l'actine sont présentes dans les cellules non-musculaires et à fortiori dans les cellules nerveuses et gliales (Kabsch & Vandekerckhove, 1992). De plus, ces deux isoformes b et g de l'actine montrent de grandes différences d'expression et de localisation. A l'inverse de l'isoforme g qui est exprimée de façon homogène, continue et ubiquitaire, l'isoforme b est induite pendant le développement puis diminue avec l'âge. Elle se restreint aux régions subissant de profonds remaniements morphologiques ou ayant une importante capacité à changer de formes comme les épines dendritiques et les cônes de croissance (voir ci-dessous, chapitre 2. 2. 2).

Plus d'une vingtaine d'isoformes différentes de la tropomyosine ont été caractérisées jusqu'à présent, mais seulement 10 isoformes au moins ont été identifiées dans le système nerveux (Lees-Miller et al., 1990, Gunning et al, 1998). Certaines isoformes comme les TMBr-1-3 sont mêmes spécifiquement exprimées par les neurones (Stamm et al., 1993 ; Weinberger et al., 1993). La tropomyosine est également présente dans les cônes de croissance (Sobue, 1993 ; Kira et al., 1995 ; Schevzov et al., 1997). Il est à noter que ces différentes isoformes de tropomyosine sont régulées de façon spatio-temporelle. Une ségrégation spatiale de ces isoformes permet de définir des régions ou domaines intracellulaires distincts sur le plan morphologique et fonctionnel contribuant en partie à la multipolarité des cellules nerveuses (Gunning et al., 1998).

Parmi les protéines se liant à l'actine, et considérées comme associées au filament d'actine au même titre que les tropomyosines, deux protéines - la caldesmone et la calponine - vont retenir particulièrement notre attention (voir ci-dessous, chapitre 2. 3 et 2. 4 et pour une revue lire Marston & Huber, 1996 ; Gimona & Small, 1996). Ces deux protéines microfilamentaires sont présentes à la fois dans les muscles lisses et dans les tissus non-musculaires bien que certaines isoformes restent spécifiquement exprimées par le tissu musculaire lisse. La caldesmone a été identifiée et purifiée à partir du système nerveux et sa présence dans l'astroglie en culture et dans les cônes de croissance a été démontrée, il s'agit de l'isoforme non-musculaire : la L-caldesmone (voir ci-dessous, chapitre 2. 3. 2 ; Abd-el-Basset et al., 1991 ; Ishikawa et al.,1992 ; Sobue, 1993 ; Tanaka & Sobue, 1995 ; Kira et al., 1995). Enfin, longtemps décrite comme spécifique des muscles lisses, la calponine n'a été que récemment découverte dans le système nerveux (Trabelsi-Terzidis et al., 1995), il s'agit d'une isoforme acide (Voir ci-dessous, chapitre 2. 4. 2) clonée pour la première fois à partir de l'aorte (Applegate et al., 1994) puis à partir du cerveau (Ferhat et al., 1996).

2. 1. 2 Régulation de l'activité actomyosine. (revenir à 2. Données bibliographiques)

Les mécanismes de régulation de l'activité actomyosine ont été essentiellement étudiés dans les systèmes musculaires. Il a ainsi été montré que les variations de calcium intracellulaire jouaient un rôle fondamental. Cependant, les muscles striés et les muscles lisses ne sont pas fonctionnellement équivalents et les mécanismes qui les régissent sont différents (Chalovich, 1993). Dans les muscles striés, la régulation de la contraction par le calcium se fait grâce à un ensemble de protéines spécifiques étroitement liées entre elles (Huxley, 1969 ; Chalovich, 1993) : ces protéines sont la tropomyosine et le complexe de troponines. La troponine I inhibe l'interaction entre les têtes de myosine et l'actine, la troponine T fixe la tropomyosine et la troponine C fixe le calcium et donne la sensibilité au calcium du système. A la différence des muscles striés, l'initiation de la contraction des muscles lisses doit être précédée d'une phosphorylation réversible des chaînes légères régulatrices de la myosine (MLC20) par la MLC kinase (MLCK). Cette étape est dépendante de la calcium-calmoduline. De plus, un mécanisme complémentaire à la phosphorylation faisant intervenir un cortège de protéines spécifiques contrôlant les interactions entre l'actine et la myosine a été mis en évidence dans les muscles lisses. Parmi ces protéines, la caldesmone et la calponine sont particulièrement bien étudiées. Bien que ces protéines fassent partie intégrante des filaments fins (voir chapitre précédent), leur rôle exact dans la régulation de la contraction des muscles lisses demeure encore relativement mal connue (Marston & Huber, 1996 ; Gimona & Small, 1996 ; Fattoum, 1997). Cependant, des études in vitro ont montré que ces deux protéines pouvaient s'associer avec des protéines qui fixent le calcium et qui sont connues pour être impliquées dans de nombreuses voies de transductions calciques. Il s'agit de la calmoduline (CaM), de la caltropine (CaT) et de la protéine S-100. De plus, il a été montré que la caldesmone et la calponine pouvaient inhiber l'activité ATPasique de l'actomyosine et empêcher le mouvement des filaments d'actine (Shirinsky et al., 1992) et que ce processus était partiellement renversé en présence de Ca2+ par la CaM, la CaT et la S-100 (Wills ; Winder).

La MLCK, la CaM, la caldesmone et la calponine sont également présentes dans les systèmes non-musculaires et dans le SNC. En revanche, bien que certains aient tenté de mettre en évidence l'existence d'un complexe de troponines (Mahendran & Berl, 1977, 1979), celui-ci est absent des cellules non musculaires et en particulier des cellules nerveuses et gliales (Anthony et al., 1984). En plus, de nombreuses isoformes différentes de myosines ont été identifiées jusqu'à présent dans divers systèmes cellulaires. Dans le SNC, on trouve la myosine I, II, V et VII qui sont caractérisées par des différences très importantes dans leur structure, leur mode d'action ou encore leur localisation subcellulaire (Hasson & Mooseker, 1997). Si bien que l'on peut supposer que des modes de régulation différents puissent exister suivant le type cellulaire et même suivant le domaine subcellulaire considéré. L'état actuel des connaissances ne nous permet pas encore de dire quelles sont les discriminations entre les différents systèmes actomyosines et quelles sont les voies de transduction impliquées dans les cellules non musculaires et en particulier dans le SNC. Nous allons maintenant décrire de façon plus détaillé les principales données publiées sur les trois protéines microfilamentaires étudiées dans cette thèse (actine, caldesmone et calponine).

2. 2 L'actine

2. 2. 1 Généralité sur l'actine. (revenir à 2. Données bibliographiques)

2. 2. 1. 1 Structure et propriétés physico-chimiques

Actine monomérique ou globulaire (actine-G)

Isolée en 1942 par Straub, l'actine est un polypeptide ubiquitaire de 374 ou 375 aminoacides dont la séquence a été hautement conservée au cours de l'évolution. Sa forme est globulaire, ses dimensions sont de 3,5 x 5,5 x 5,5 nm et son poids moléculaire est égal à 42,3 kilodaltons (kDa). C'est une protéine acide avec un point isoélectrique (pI) d'environ 5,4. L'actine possède un site de fixation pour les nucléotides (ATP/ADP) et plusieurs sites de fixation pour les cations (calcium et magnésium). Dans des conditions de faible concentration protéique, de température basse et en absence de sel, l'actine est monomérique. Sa structure en trois dimensions est détaillée fig. 5.

L'une des propriétés fondamentales de l'actine est de pouvoir se polymériser et se dépolymériser de façon réversible. L'association des monomères d'actine pour former des filaments a été décrite par Oosawa et coll. (1962) comme une réaction de condensation coopérative typique des processus d'auto-assemblages des macromolécules hélicoïdales (pour une revue lire Oosawa & asakura, 1975). Ce processus ne peut se produire que si la concentration de l'actine monomérique est supérieure à une valeur critique (concentration critique de polymérisation). Elle est définie comme étant la concentration d'actine minimale nécessaire pour former des polymères stables en solution. Sa valeur dépend, entre autre, des conditions ioniques, du pH et de la température du milieu. La polymérisation de l'actine G peut être induite in vitro par simple incubation en présence de concentration physiologique de sels monovalents (KCl) ou divalents (MgCl2). D'une manière schématique, la réaction de polymérisation se déroule en trois étapes réversibles qui se succèdent :

1- L'activation du monomère (l'actine G) : Cette étape implique une liaison avec un cation et avec un nucléotide triphosphate : l'ATP. (actine G + cation + ATP => actine G* activée). Elle consiste à changer la conformation de l'actine, la rendant plus apte à se polymériser. L'interaction entre deux monomères est alors favorisée.

2- La nucléation : Elle correspond à l'association de 3 monomères d'actine pour former des petits oligomères ou " noyaux " stables dont la probabilité de s'associer est supérieure à celle de se dissocier. La nucléation est une étape lente qui dépend fortement de la concentration monomèrique d'actine (pool d'actine libre) mais est également dépendante de nombreux facteurs physico-chimiques (force ionique, température...) et protéiques (protéines de nucléation).

3- L'élongation bidirectionnelle du filament d'actine : Elle résulte de l'ensemble des réactions d'association et de dissociation des monomères d'actines aux deux extrémités du filament. C'est une étape beaucoup plus rapide qui s'accompagne d'une hydrolyse de l'ATP fixée au monomère. Le filament s'enrichit ainsi en sous-unités d'actine-ADP au fur et à mesure de l'élongation. Néanmoins, le filament d'actine peut être coiffé à l'une de ses extrémités et l'élongation ne pourra se faire qu'à l'autre extrémité.

Actine polymérique ou filamenteuse (actine-F)

L'actine-F (formée de chapelets d'actines-G torsadés en double hélice a droite) représente un état structural important de l'actine car de nombreuses fonctions physiologiques des cellules reposent sur l'existence de cette forme polymérisée (différentiation cellulaire, adhésions focales, contraction cellulaire, ancrage des récepteurs membranaires, transport cellulaire, etc.). Cet état est en perpétuel changement et l'actine continue de se polymériser et de se dépolymériser sans cesse (Welch et al., 1997) : cela correspond à un état stationnaire dans lequel les polymères d'actine coexistent avec une concentration constante de monomères égale à la concentration critique. Les paramètres cellulaires (osmolarité, pH, environnement protéique, concentration d'ATP/ADP, concentration calcique, etc.) peuvent faire varier localement la longueur des filaments ou entraîner une redistribution plus large et induire des remodelages cellulaires. De plus les deux extrémités du polymère ne sont pas équivalentes. Cette différence due à la conformation de la protéine peut être mise en évidence en décorant les filaments d'actine par des têtes de myosine S1 (lesquelles ont une forte affinité pour l'actine-F ; Ka = 108 M-1). Il existe ainsi une extrémité pointue (-) où l'association des monomères est plus lente que leur dissociation permettant à l'actine de se dépolymériser, et une extrémité barbée (+) ou l'inverse se produit, permettant à l'actine de se polymériser. On appelle ce phénomène le " treadmilling " des filaments d'actine (voir fig. 6 ; l'état stationnaire : Schéma de polymérisation). L'instabilité dynamique des filaments d'actine à l'état stationnaire est une autre conséquence de l'hydrolyse tardive du nucléotide ATP en ADP + Pi.

2. 2. 1. 2 Isoformes et variants génétiques

Chez les mammifères, il existe au moins six isoformes codées par six gènes différents qui possèdent environ >90% d'homologie, mais seulement 50-60% d'homologie dans les 18 premiers résidus N-terminaux. Chaque isoforme possède ainsi une séquence N-terminale propre et unique (fig. 7) (Vandekerckhove & Weber, 1978 a et b ; Kabsch & Vandekerckhove, 1992). Ces six actines ne peuvent être séparées entre elles par une simple éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) mais le peuvent en fonction de leur charge électrique par des gels en deux dimensions (isoélectrofocalisation et SDS-PAGE) : on dénombre ainsi 3 formes a, b et g classée par ordre d'acidité décroissante (pI=5,39 à 5,44). Il y a trois actines alpha différentes (présente dans les muscles striés squelettiques, dans le muscle strié cardiaque et dans les muscles lisses), deux actines gamma différentes (muscle lisse et tissu non-musculaire) et une isoforme bêta non musculaire (présente également dans les muscles lisses et les muscle striés).

Figure 7 : Séquences amino-terminales des différentes isoformes d'actine mammaliennes :

Ac-DEDETTALVCDNGSGLVK actine alpha (muscle squelettique)

Ac-DDEETTALVCDNGSGLVK actine alpha (muscle cardiaque)

Ac-DDDIAALVVDNGSGMCK actine bêta (non musculaire)

Ac-EEEDSTALVCDNGSGLCK actine gamma (muscle lisse)

Ac-EEEIAALVIDNGSGMCK actine gamma (non-musculaire)

 

2. 2. 2 Actine bêta. (revenir à 2. Données bibliographiques)

2. 2. 2. 1 Généralité (caractéristiques, fonctions, localisations)

De nombreuses expériences de manipulations génétiques (transfections cellulaires) sur l'expression des isoformes non musculaire de l'actine (b et g) dans différents types cellulaires (myoblastes, fibroblastes, etc.) ainsi que sur leur localisation précise au niveau subcellulaire ont montrées que ces protéines étaient impliquées dans la régulation de la morphologie et de la motilité des cellules (Schevzov et al., 1992 ; Kislauskis et al., 1994 ; von Arx et al., 1995 ; Mounier et al., 1997), et ce à la différence des autres isoformes (a) qui seraient plus spécifiquement impliquées dans la contraction cellulaire. Les gènes de l'actine b et g coderaient pour des informations cytoarchitecturales distinctes. Ainsi il at été montré que la surexpression de l'isoforme b dans des myoblastes transfectés induisait une augmentation de leur surface cellulaire et était également accompagnée de changements dans l'organisation des microfilaments (Schevzov et al., 1992) ; à l'inverse, l'isoforme g induisait, quant à elle, une diminution de la surface cellulaire. L'isoforme b serait alors spécifiquement impliquée dans l'étalement des cellules, mais également dans l'émergence et le maintien des structures lamellipodiales (Kislauskis et al., 1994). De plus, la localisation de l'actine b est confinée aux régions de remaniements morphologiques et de motilité cellulaire (DeNofrio et al., 1989 ; Hoock et al., 1991 ; Kislauskis et al., 1994, 1997). L'ensemble des données acquises à ce jour montre, d'une manière générale, que l'actine b est majoritairement localisée dans la périphérie cellulaire (cortex cellulaire) sous la membrane plasmique (Hoock et al., 1991 ; Hill & Gunning, 1993 ; Gimona et al., 1994). Certains travaux ont même suggéré que l'actine b soit spécifiquement associée aux jonctions neuromusculaires des muscles striés et aurait peut-être un rôle à jouer dans la modulation de l'activité et de l'ancrage de recepteurs cholinergiques (Hall et al, 1981 ; Lubit, 1984). L'absence d'actine b au niveau de l'appareil contractile des muscles lisses et son enrichissement dans les régions membranaires et cytosqueletiques (contenant les filaments intermédiaires de desmine) supportent également la notion d'un rôle particulier pour l'actine b (North et al., 1994). De plus, il a été montré que certaines protéines pourraient se lier spécifiquement aux filaments d'actine b (Shuster & Herman, 1995 ; Shuster et al., 1996 ; Yao et al., 1996). Ainsi, l'ezrine qui appartient à la famille des protéines ERM (Ezrin/Radixin/Moesin) reliant le cytosquelette à la membrane plasmique, se lie indirectement et préférentiellement avec l'actine b et non avec l'actine a ; cette association est modulée par le calcium et la cytochalasine D (Shuster & Hermann, 1995). Par la suite, ces mêmes chercheurs ont identifié une nouvelle protéine, nommée beta cap73, qui interagit spécifiquement avec l'actine b et avec l'ezrine. Ces données suggèrent que beta cap73 puisse jouer un rôle dans l'association entre l'actine b et l'ezrine mais également dans la régulation de la localisation de ces protéines (ciblage) ainsi que dans la formation de protrusions cellulaires et de lamellipodes (Shuster et al., 1996). L'ensemble de ces données laisse entrevoir que ces aspects fonctionnels puissent également être présents dans les cellules du système nerveux central mais jusqu'à présent, la distribution-localisation de ces deux isoformes de l'actine et leur contribution différentielle aux fonctions neuronales et gliales ainsi que leur implication dans la plasticité neurale n'a été que récemment entreprise.

2. 2. 2. 2 Actine bêta et système nerveux

Comme nous l'avons décrit, les deux seules isoformes de l'actine présentes dans les cellules nerveuses et gliales sont l'actine b et g (Erba et al., 1988). Plusieurs travaux ont montré que l'actine b pouvait avoir un rôle important dans les transformations morphologiques et plastiques des cellules du système nerveux (pour une revue lire : Gunning et al., 1998). Il a ainsi été montré que l'actine b et son messager étaient régulés pendant le développement cérébral (Chiba et al., 1990 ; Weinberger et al, 1996) avec des niveaux d'expression plus importants autour de la naissance (jusqu'à P7 pour la souris) et qu'elle était présente dans les axones immatures en développement et absente des axones matures adultes (Weinberger et al, 1996). De plus, l'actine b est essentiellement enrichie dans les extrémités terminales des neurites, dans les cônes de croissance et sous la membrane plasmique des cellules nerveuses en culture (Ulloa & Avila, 1996 ; Bassel et al, 1998) ; ces régions possèdent de grandes capacités à se réorganiser. A l'inverse, notons que l'actine g est exprimé de façon plus homogène et que sa localisation concerne aussi bien le corps cellulaire que les prolongements à n'importe quel stade de développement (cônes de croissance, axones et dendrites).

La quantité relative de ces deux isoformes pendant la différentiation des neuroblastes en culture varie en fonction de l'extension et de la croissance neuritique. Ce rapport passe d'environ 60% g / 40% b dans la cellule ronde indifférenciée à environ 80% g / 20% b dans le neurone mature (Ulloa & Avila, 1996). Des expériences d'hybridation in situ et de transfection ont également montré que les isoformes b et g de l'actine - à l'inverse de l'isoforme a du muscle cardiaque - sont correctement ciblées et localisées dans les épines dendritiques de neurones d'hippocampe en culture (Kaech et al, 1997). Un récent papier décrit même un enrichissement de l'actine b dans les épines dendritiques in vivo pendant le développement et chez le rat adulte (Micheva et al., 1998).

De surcroît, il est très intéressant de noter que le messager de l'actine b est également régulé dans le sens d'une augmentation de sa synthèse pendant la régénération axonale (Lund & Mc Quarrie, 1996). De nombreuses études avaient déjà montré qu'il y avait de profonds changements dans l'expression des différentes sous-unités et isoformes microtubulaires et neurofilamentaires après axotomie. Il semblerait ainsi que l'expression des protéines du cytosquelette pendant la régénération axonale récapitule le programme de développement (Hoffman & Cleveland, 1988).

L'ensemble de ces données montre que l'actine b serait largement impliquée dans les remodelages neuronaux. La présence de l'actine b dans les cellules gliales, au même titre que dans toutes les autres cellules (musculaires et non-musculaires) suggère que sa localisation et sa fonction puissent être semblables à celles des neurones. Néanmoins aucune donnée n'a été publiée sur la distribution de l'actine bêta dans la glie. Y a t-il ainsi des différences entre les cellules nerveuses et les cellules gliales ? Et entre les différentes cellules gliales elles-mêmes ? Quels types de modifications peut-il y avoir pendant le développement et après lésions ? L'actine bêta est-elle impliquée dans les remaniements de la glie réactive ?

2. 2. 3 Protéines associées à l'actine. (revenir à 2. Données bibliographiques)

Il existe un très grand nombre de protéines et d'isoformes qui interagissent avec l'actine monomérique ou polymérique. Le but de ce chapitre n'est donc pas de répertorier chacune d'entre elles de manière exhaustive. Nous nous contenterons de présenter les différentes classes de protéines se liant à l'actine, afin de mieux comprendre où se placent la caldesmone et la calponine. Puis nous résumerons les principales données qui ont été obtenues sur les protéines se liant à l'actine dans le système nerveux central afin de pouvoir comparer leur distribution, leur localisation et leur expression (pour une revue lire : Bamburg & Bernstein, 1991).

Ces différentes protéines peuvent être divisées en 8 catégories en fonction du type d'interaction avec l'actine G ou F et du rôle principal qui leur est accordé ; certaines d'entre elles peuvent entrer dans plusieurs catégories à la fois ; il y a ainsi :

1) Celles qui interagissent avec l'actine G et qui séquestrent le monomère (ex : la profiline). 2) Celles qui interagissent avec l'actine G, qui séquestrent le monomère et qui fragmente l'actine F (ex : l'ADF, la cofiline). 3) Celles qui interagissent avec l'actine G, qui fragmentent l'actine F et qui coiffent le monomère (ex : la fragmine, la gelsoline). 4) Celles qui interagissent avec l'actine G et qui coiffent le monomère (ex : CAP 90). 5) Celles qui interagissent avec l'actine F, qui induisent l'assemblage des monomères et qui stabilisent le polymère (ex : la tropomyosine, la caldesmone, la calponine, la cofiline). 6) Celles qui interagissent avec l'actine F et qui fasciculent ou réticulent le polymère (ex : la spectrine, la synapsine, l'ameline, l'alpha-actinine, la filamine, MAP-2, la caldesmone, la calponine). 7) Celles qui interagissent avec l'actine F et qui accrochent le polymère à la membrane ou aux protéines membranaires (ex : l'ankyrine, la vinculine, l'alpha-actinine, la taline, l'ezrine, PSD 95). Et 8) Celles qui interagissent avec l'actine F et qui possèdent une activité enzymatique (ex : la myosine, certains enzymes glycolytiques).

Parmi les principales protéines se liant à l'actine et qui ont été identifiées dans le SNC, on trouve : L'ADF ou actin-depolymerizing factor (n, ax, t, d, c, f), l'adducine (i), l'alpha-actinine (n, d, é, c, f), l'ameline (n, d), l'alpha-ankyrine (n, d), la bêta-ankyrine (n, ax, d, c, f), BIP (i), CAP 90 (i), la cofiline (i), la cortactine (), la cytosynaline (), la destrine (i), la drebrine (n, é), les dystrophines (n, g), la fascine (i), la filamine (n, c, f), la fimbrine (n, c, f), la fragmine (), la gelsoline (n, c, o), MAP-2 (n, d, é), les myosines I (n, d, c, f, g), II (n, d, ax, t, c, f, g), V () et VII (), la profiline (i), la PSD 95 (n, d, é), la SAP 90 (n, d, é), la severine (i), la spectrine ou fodrine (n, d, ax, t, c), la synapsine (n, t), la taline (n, c, f), les tropomyosines (u), la vinculine (n, c, f, g). Entre parenthèse est indiqué les endroits où la protéine a été localisée. Ceci n'exclue pas que la protéine puisse également être présente ailleurs mais cela n'a pas été rapporté.

Localisation rapportée : inconnue (i), ubiquitaire (u), cellules nerveuses (n), dendrite mature (d), épines dendritiques (é), axone mature (ax), terminaison présynaptique (t), cône de croissance (c), filopodes (f), cellules gliales (g), astroglie (as), oligodendroglie (o) et microglie (m).

La caldesmone et la calponine vont maintenant faire l'objet d'une étude plus détaillée.

2. 3 La caldesmone

2. 3. 1 Généralité sur la caldesmone. (revenir à 2. Données bibliographiques)

La caldesmone a été isolée pour la première fois en 1981 à partir du muscle lisse de gésier de poulet par Sobue et al. (du groupe du Dr S. Kakiuchi). Elle a été caractérisée comme étant une protéine de haut poids moléculaire se liant à l'actine mais aussi à la Ca2+-calmoduline ; d'où son nom qui vient de calmoduline et de desmos (du grec " lier "). En 1984, le même groupe de recherche a mis en évidence une autre isoforme plus petite et plus légère exprimée par les tissus non-musculaires (Ishimura et al., 1984 ; Fujita et al., 1984). En 1985, Marston et al. ont également purifié la caldesmone à partir du muscle lisse de l'aorte de bœuf et ainsi confirmé que la caldesmone était une protéine intimement liée aux microfilaments suggérant qu'elle puisse jouer un rôle prépondérant dans la stabilisation du système microfilamentaire et dans la régulation de la contraction des muscles lisses. Dans le muscle lisse cette protéine est concentrée au niveau de l'appareil contractile. Cette protéine a été par la suite très étudiée pour sa capacité à inhiber l'activité ATPasique de l'actomyosine. Elle a permis d'envisager l'existence d'une régulation protéique de la contraction au sein des systèmes musculaires lisses et non-musculaires mais a permis également de mieux caractériser la structure et la composition des microfilaments dans ces mêmes systèmes. Bien que l'ensemble des travaux se soient focalisés sur la caldesmone de haut poids moléculaire spécifiquement exprimée par les muscles lisses, il a été montré que la forme légère exprimée par les tissus non-musculaires possédait quasiment les mêmes propriétés que sa grande sœur.

2. 3. 1. 1 Structure et propriétés physico-chimiques (fig. 13)

La caldesmone est une protéine qui présente une grande résistance à la chaleur, qui est soluble dans l'acide mais qui est extrêmement sensible à la protéolyse. La plupart des techniques de purification utilisent ces propriétés pour l'extraire. Le passage en pH acide (1M HCl) précipite les autres protéines. Puis, en pH neutre, la caldesmone est relarguée entre 30 et 50% de sulfate d'ammonium. La purification de la caldesmone est achevée par filtration sur colonne de Sephadex G150 et par chromatographie d'affinité (calmoduline en présence de calcium) (Marston & Huber, 1996). Il s'agit d'une protéine de forme allongée (53 à 74 nm de long ; diamètre = 2nm) et de poids moléculaire apparent (en SDS-PAGE) variant de 71 à 83 kDa pour la forme légère (CD-l) et de 120 à 150 kDa pour la forme lourde (CD-h). Sa forte teneur en acide glutamique ainsi que sa forme allongée en bâtonnet explique que la caldesmone migre de façon anormale en SDS-PAGE. Ainsi, son vrai poids moléculaire est de 59-63 kDa pour la CD-l et de 89-93 kDa pour la CD-h. Son point isoélectrique varie de 5,7 à 7,2. L'observation en microscopie électronique et par résonance magnétique de la caldesmone purifiée ainsi que l'étude de sa séquence montrent qu'elle est faite de quelques sections ou régions longues et rigides jointes par des petites connexions ou charnières flexibles (Mabuchi & Wang, 1991) définissant 4 domaines moléculaires (fig. 10). Enfin, la caldesmone interagit avec l'actine-F, facilite la polymérisation de l'actine et intervient dans la stabilisation des microfilaments ; elle est également capable d'inhiber l'activité actomyosine et d'interagir avec de nombreuses autres protéines telles que la myosine, la tropomyosine ou la calmoduline.

2. 3. 1. 2 La caldesmone comme composant des microfilaments

La caldesmone interagit avec l'actine-F et la tropomyosine. Elle colocalise très bien avec les microfilaments dans les différents types cellulaires étudiés (cellules musculaires lisses, fibroblastes, astrocytes, etc.). Un modèle, tenant compte de la structure du filament et des protéines, place la caldesmone, dans le sillon du filament d'actine (double hélice), suivant son axe, à coté de deux molécules de tropomyosine et recouvrant 14 monomères d'actine (fig. 8). Deux types de sites de fixation ont pu être mis en évidence entre la caldesmone, la tropomyosine et l'actine-F, en faisant varier la concentration de caldesmone/actine-tropomyosine. Un premier site de haute affinité (CD/actine-TM = 0,06) avec une constante d'association de Ka1 = 4 . 107 M-1 et un deuxième site de faible affinité (CD/actine-TM = 0,75) avec une constante d'association de Ka2 = 5 . 105 M-1. En utilisant divers fragments recombinants de la caldesmone, de la tropomyosine et de l'actine, les différents sites de fixation et d'association ont pu être ainsi déterminés. Il est à noter que l'affinité de la caldesmone pour la tropomyosine est quatre fois supérieure lorsque la tropomyosine est déjà liée à l'actine-F. De plus, la CD et la TM se lient de façon antiparallèle. Les seuls véritables sites de fixation de la CD pour l'actine (Ka ? 105 M-1) se trouvent sur le domaine 4 (C-terminal) et interagissent avec l'actine sur sa partie N-terminale, entrant en compétition avec la myosine. A titre d'indication, la caldesmone se fixe au sous-fragment S2 de la myosine par son domaine 1 (N-terminal). Le domaine 4 est une région hautement conservée qui comporte tous les sites d'interaction avec les protéines régulatrices telles que la calmoduline.

2. 3. 1. 3 Inhibition de l'activité actomyosine

Comme nous venons de le voir, la caldesmone est capable d'interagir avec l'actine-F, avec la tropomyosine et avec la myosine. Cette intimité fait de la caldesmone un candidat privilégié pour réguler les interactions entre ces trois protéines et pour moduler l'affinité de la myosine pour l'actine (ou réciproquement) et empêcher ainsi le pivotement de la tête S1 de la myosine (fig. 9). Ainsi, de nombreux travaux ont pu montrer que la caldesmone inhibait de façon tropomyosine dépendante l'activité Mg-ATPasique de l'actomyosine (pour une revue détaillée consulter Marston & Huber, 1996). Nous ne développerons pas ici l'ensemble des caractéristiques sur les mécanismes moléculaires mais nous résumerons les principales données. L'analyse enzymatique révèle qu'in vitro la caldesmone augmente le Km de l'ATPase mais ne modifie nullement sa Vm. Cet effet peut se traduire par une compétition directe entre la caldesmone et la myosine S1-ADP.Pi pour un site commun de fixation à l'actine. Cette inhibition (env. 70-98%) est observée in vitro pour un rapport de 1 CD : 1 actine : 1 S1 ; or, in vivo, il y a seulement une caldesmone pour 14 actines, si bien que pas plus de 5 à 7% d'inhibition par ce mécanisme ne serait possible. Néanmoins, en présence de tropomyosine, l'inhibition est potentialisée. La tropomyosine n'a pas de capacité propre à inhiber l'actomyosine, mais entre en concert avec la caldesmone en interagissant avec elle. On peut ainsi proposer un modèle similaire à celui du complexe tropomyosine-troponines présent dans les muscles striés. Dans ce cas, la caldesmone est présentée comme un effecteur allostérique agissant comme un interrupteur (on/off) sur le couple actine-tropomyosine. La coopérativité s'expliquant par le fait que deux tropomyosines agissent sur 14 actines comme sur une seule actine et ce même si la caldesmone ne fixait qu'une seule actine. Dans ce cas, le domaine 4 de la caldesmone agirait comme la troponine I entrant en compétition avec la myosine (d'ailleurs les divers peptides recombinants ou obtenus par protéolyse du domaine 4 sont tous d'importants inhibiteurs de l'activité Mg-ATPasique), le reste de la molécule agirait comme la troponine T et fixerait les deux tropomyosines. L'équivalent de la troponine C pourrait être la calmoduline vraisemblablement ou une autre protéine fixant le calcium (fig. 9) ; la caldesmone ayant une très grande affinité pour la calcium-calmoduline (Ka = 106 M-1) mais aussi pour la caltropine, la protéine S100 et la SMCaBP-11. Néanmoins, même si ce modèle est très attractif, il ne peut expliquer toutes les nuances de la contraction des muscles lisses. D'autres fonctions, peut-être attribuables à la caldesmone elle-même ou à d'autres facteurs sont nécessaires pour comprendre notamment cette particularité qu'ont les muscles lisses de rester dans un état de tension pendant une période où aucune contraction nouvelle n'est possible, ceci étant une caractéristique de l'état fonctionnel de la contraction des muscles lisses (appelé " latch state "; latch = loquet, latch state = état bloqué). Il est possible d'envisager, de par le fait qu'elle interagisse à la fois avec la myosine et l'actine que la caldesmone puisse participer à ce phénomène. Il est à noter également que le muscle lisse peut développer des forces de tension même quand les cellules musculaires lisses sont très étirées et ce à la différence des muscles striés .

2. 3. 1. 4 Isoformes et variants génétiques

Jusqu'à présent, un seul type de gène codant pour la caldesmone a été découvert, cloné et séquencé dans les différentes espèces étudiées (Hayashi et al., 1989 ; Bryan et al., 1989 ; Hayashi et al., 1991 ; Bryan & Lee, 1991 ; Humphrey et al., 1992) (fig. 11). Ce gène comporte 14 exons. Les différentes isoformes qui ont été caractérisées proviennent donc d'un épissage alternatif du messager (fig. 10) où l'exon 3b et/ou 4 sont supprimés. Deux grands isotypes sont ainsi décrits : il s'agit de la H-caldesmone (CD-h ; " h " pour high molecular weight) et de la L-caldesmone (CD-l, " l " pour low molecular weight). Plusieurs subisoformes ont été également caractérisées et mises en évidence par des gels en deux dimensions correspondant à des modifications post-traductionnelles de la protéine (essentiellement des phosphorylations). La caldesmone possède également une petite homologie de séquence avec la troponine T (43% d'homologie entre les résidus 565-621 du domaine 3 de la CD-h et les résidus 90-146 de la troponine T).

2. 3. 2 L-caldesmone. (revenir à 2. Données bibliographiques)

2. 3. 2. 1 Généralité (fonctions ; localisation)

Dés 1984, de nombreuses publications ont montré que la caldesmone n'était pas restreinte aux muscles lisses mais se trouvait également dans les tissus non-musculaires (Ishimura et al., 1984 ; Fujita et al., 1984 ; Koji-Owada et al., 1984 ; Bretscher & Lynch, 1985). Cette isoforme non-musculaire (la L-caldesmone) de plus bas poids moléculaire que la caldesmone spécifique des muscles lisses (la H-caldesmone), possède néanmoins un grand nombre de propriétés in vitro en commun. La microinjection de l'une ou de l'autre de ces isoformes dans des fibroblastes en culture montre que les deux protéines sont capable de s'incorporer dans les microfilaments et les fibres de stress (cette incorporation étant retardée en présence de calcium-calmoduline), alors que la L-caldesmone est incapable de le faire dans des cellules musculaires lisses différenciées (Yamakita et al., 1990). La séquence complète en aminoacide de ces isoformes a été déterminée (fig. 11). A la différence de la H-caldesmone, la L-caldesmone ne possède pas un motif central comportant 9 à 10 séquences répétées de résidus hautement chargés, et servant d'espaceur entre les domaines N et C-terminaux (fig. 10). Cependant, comme nous venons de le voir (chapitres 2.2.1.2 et 2.2.1.3), la quasi-totalité des propriétés d'interaction de la caldesmone réside dans les extrémités N et C-terminales. Ainsi, les deux protéines sont capables de se fixer sur les filaments d'actine, d'inhiber l'activité actomyosine, et sont modulées par la calmoduline (Sobue & Sellers, 1991). La L-caldesmone est aussi résistante à la chaleur et à l'acide. C'est une protéine monomérique de forme allongée mais plus courte (53nm), le rayon de stokes étant égale à 60,5 Å et le coefficient de sédimentation S20,w égale à 3,5 en présence d'agents réducteurs. En l'absence d'agents réducteurs, la protéine a tendance à s'auto-associer en oligomères par l'intermédiaire de ponts disulfides. Enfin, in vitro, elle a une localisation périodique le long des filaments d'actine (Yamashiro-Matsumura & Matsumura, 1988).

Bien que l'étude de la contraction cellulaire dans les tissus non-musculaires soit plus délicate, il y a cependant certaines fonctions physiologiques qui seraient susceptibles d'être modulées par la L-caldesmone. Le rôle possible de la caldesmone comme facteur essentiel dans la réorganisation des filaments d'actine a été étudié. Ainsi, il a été montré que la L-caldesmone était impliquée dans l'inhibition du " capping " et de la fragmentation de l'actine-F par la gelsoline (Ishikawa et al., 1989a et b). La caldesmone peut induire la polymérisation de l'actine même en présence de profilactine (profiline + actine-G) (Galazkiewicz et al., 1989 et 1991). La surexpression de fragments CaD39 de la caldesmone (extrémité C-terminale contenant les sites de fixation à l'actine, à la tropomyosine et à la calmoduline) permet de stabiliser les faisceaux de microfilaments, augmentant l'adhésion, l'étalement et la différenciation des cellules (Warren et al., 1994 ; Warren et al., 1996) et retardant ainsi l'induction de la division cellulaire.

De plus, Yamashiro et Matsumura ont mis en évidence que la caldesmone pouvait être impliquée dans les remaniements microfilamentaires observés lors de la division cellulaire (Yamashiro-Matsumura & Matsumura, 1991). La phosphorylation, in vivo, de la L-caldesmone par la p34 cdc2 kinase (une des unités catalytiques du MPF, maturation and mitosis promoting factor) permet sa dissociation des filaments d'actine (Yamashiro et al., 1990). Ce mécanisme pourrait expliquer le désassemblage des fibres de stress et permettrait d'augmenter l'accessibilité des filaments d'actine aux protéines de fragmentation pendant la prophase ainsi que la formation transitoire d'un anneau contractile (actomyosine) lors de la séparation des cellules filles en fin de mitose (télophase). Lors de la métaphase, au moment de la séparation des chromosomes, la L-caldesmone est distribuée de façon diffuse. Puis, quand les cellules filles commencent à s'étaler et à se différencier, la L-caldesmone montre dèslors une forte colocalisation avec les microfilaments (Hosoya et al., 1993).

Il a été montré également qu'il existait une corrélation entre l'augmentation de la synthèse de caldesmone induite par les glucocorticoïdes et la stabilisation des filaments d'actine. Ces données suggèrent que la stabilisation des microfilaments puissent empêcher la sécrétion de corticotropine (Castellino et al., 1992 ; Castellino et al., 1995). Janovick et al. avaient déjà montré en 1991 que l'injection d'anticorps anti-caldesmone avait un effet synergique avec la GnRH (gonadotropin release hormone) sur la libération de l'hormone lutéinisante (LH), suggérant que la caldesmone puisse être impliquée dans l'inhibition de la sécrétion cellulaire (Janovick et al., 1991). De plus, la L-caldesmone pourrait également intervenir dans les processus de remaniement morphologique, de déformation et de résistance des érythocytes (Der Terrossian et al., 1989 ; 1994).

Bref, comme nous venons de le voir, la L-caldesmone est impliquée dans de nombreuses fonctions physiologiques des cellules non-musculaires faisant intervenir la dynamique des microfilaments. Mais qu'en est-il dans le système nerveux ?

2. 3. 2. 2. L-caldesmone et système nerveux

La caldesmone avait été identifiée par immunoblotting dans des extraits de cerveau de poulet (Ngai & Walsh, 1985). Depuis, elle a été purifiée à partir du cerveau (Ishikawa et al., 1992) et il a été montré qu'elle était présente dans les cellules nerveuses et gliales en culture (Abd-El-Basset et al., 1991 ; Sobue, 1993 ; Kira et al., 1995). Dans ces cellules, elle colocalise très bien avec les filaments d'actine et avec la tropomyosine au niveau des fibres de stress et du cortex cellulaire des astrocytes (Abd-El-Basset et al., 1991) et dans les cônes de croissance des neurones (Kira et al., 1995 ; fig. 12). La myosine est également présente dans ces régions mais aucun comarquage n'a été réalisé avec la caldesmone. Enfin, Kira et collaborateurs ont bien précisé que l'isoforme exprimée était la L-caldesmone de bas poids moléculaire (env. 80 kDa) et ce à partir d'homogénats de cerveau de rat. Enfin, un travail relativement récent a montré qu'un traitement répété avec de l'amphétamine augmentait la teneur en calmoduline et en caldesmone dans le striatum et que ce phénomène était bloqué avec de l'halopéridol (antagoniste des récepteurs dopaminergiques) et du MK-801 (antagoniste des récepteurs NMDA), suggérant que ces récepteurs soient impliqués dans cette activation (Gnegy et al., 1996). Néanmoins, aucune donnée sur l'expression et la distribution in vivo de la caldesmone dans le SNC n'avait été rapportée. Quels sont les types cellulaires qui expriment la caldesmone in vivo ? La caldesmone est-elle présente dans les dendrites, les épines dendritiques, les axones, les terminaisons axonales, etc ? colocalise-t-elle avec l'actine, la myosine, ou/et avec d'autres protéines ? Quelles différences pourrait-on observer pendant le développement et après lésions ?

2. 4 La calponine

2. 4. 1 Généralité sur la calponine. (revenir à 2. Données bibliographiques)

La calponine a été isolée et purifiée pour la première fois par Takahashi, K., Hiwada, K., et Kokubu, T., en 1986 à partir d'une fraction soluble acide traitée à la chaleur de muscle lisse de gésier de poulet. Elle a été caractérisée comme une protéine basique de 34 kDa se liant à l'actine filamentaire en présence ou en absence de tropomyosine, et succinctement nommée p34K. Cette liaison a pu être modulée par la calcium-calmoduline (Takahashi et al., 1986). Elle fût par la suite clonée et séquencée et révéla des homologies de séquence avec une protéine spécifique des muscles lisses, la SM22, protéine très peu connue et mal caractérisée (Pearlstone et al., 1987), mais également avec d'autres protéines mieux connues telle que la troponine T (Vancompernolle et al., 1990 ; Takahashi & Nadal-Ginard, 1991). Cette dernière est spécifiquement exprimée par les muscles striés et joue un rôle fondamental dans la régulation de l'activité actomyosine (voir introduction générale). Le nom de calponine vient de cette ressemblance avec la troponine et du fait que, comme la caldesmone, elle interagit avec la Ca2+-calmoduline in vitro (Ka = 4,54 MM-1). Ces indices ont par conséquent amené les chercheurs à tenter de déterminer son rôle dans la contraction des muscles lisses (au même titre que la caldesmone). Par la suite, d'autre isoformes de la calponine ont été identifiées, notamment dans les systèmes non-musculaires où il s'est avéré qu'une isoforme acide de 36 kDa était présente dans de nombreux types cellulaires et particulièrement enrichie dans le cerveau (Applegate et al., 1994 ; Trabelsi-Terzidis et al., 1995 ; Ferhat et al., 1996).

2. 4. 1. 1 Structure et propriétés physico-chimiques (fig. 13)

Ces données ont été majoritairement obtenues à partir de l'étude de la calponine basique des muscles lisses. La purification de la calponine basique repose, comme la caldesmone, sur des propriétés de résistance à la chaleur, de solubilité dans l'acide et de précipitation au sulfate d'ammonium. Dans des conditions non dénaturantes en solution, la calponine est monomèrique. Sa charge électrique est très importante (caractère basique) ce qui explique en grande partie sa solubilité dans des solutions acides et sa précipitation par des sels alcalins ; néanmoins les différentes isoformes identifiées jusqu'à présent le sont notamment en fonctions de leur capacité à migrer différemment par isoélectrofocalisation. Leur point isoélectrique varie ainsi de 5,2 pour la forme la plus acide (Applegate et al., 1994) à 9,9 pour la forme la plus basique (Takahashi & Nadal-Ginard, 1991). Le coefficient d'extinction E277/1% de la calponine basique de muscle lisse est compris entre 8,9 chez le porc (Wills et al., 1995) et 11,3 chez les oiseaux, i.e. le poulet (Winder et al., 1990, 1991). Le rayon de Stokes est compris entre 27,1 Å (gésier de poulet) et 27,8 Å (aorte de bœuf). Et le coefficient de sédimentation S020W est de 3,16 (Takahashi et al., 1988). Sa masse moléculaire varie entre 32,3 kDa et 36,4 kDa (Gimona & Small, 1996). Sa taille est de 16,2 nm de long et de 2,6 nm de diamètre (Stafford et al., 1995). L'ensemble de ces données permet de définir la calponine comme une petite protéine hydrophile, longiforme, flexible et hautement chargée. Parmi les différentes propriétés que possèdent, en sus, les calponines, il y a la possibilité d'interagir avec l'actine filamentaire (actine-F) et avec de nombreuses protéines (fig. 14). Parmi ces protéines, citons par exemple la caltropine (Ka = 7,7 MM-1) et la protéine S100 (Ka = 33,3 MM-1) deux protéines liant le calcium qui pourraient être impliquées dans la régulation de l'association de la calponine avec l'actine (Will et al., 1993 ; Fujii et al., 1994). Il est intéressant de noter et de préciser que la protéine S100 est particulièrement bien concentrée dans la macroglie et notamment dans les cellules de Schwann. Citons également la desmine (Ka = 0,33 MM-1) qui pourrait jouer un rôle particulier avec la calponine dans la tension cellulaire (Wang & Gusev, 1996). Dans les muscles lisses, la calponine se trouve à la fois dans les domaines contractiles mais également dans les domaines cytosqueletiques où elle se concentre au niveau des filaments intermédiaires de desmine (North et al., 1994). Il a aussi été montré que la calponine pouvait interagir de façon plus importante avec les tétramères de desmine et pourrait faire même partie intégrante des filaments de desmine dans les corps denses des muscles lisses (Mabuchi et al., 1997). Néanmoins ces associations sont mesurées in vitro et leur signification physiologique reste parfois incertaine.

2. 4. 1. 2 La calponine comme composant des microfilaments

La constante d'association de la calponine pour l'actine dans le système musculaire lisse est de 22,2.106 M-1 (fig. 14). La provenance de l'actine influence grandement cette interaction. En effet, l'actine des muscles striés ne s'associe plus avec la calponine basique des muscles lisses qu'avec une constante de 2,85.106 M-1 (Winder et al., 1991). Cette association est indépendante de la présence de la tropomyosine bien qu'il puisse y avoir une faible interaction entre la calponine et la tropomyosine.

Les expériences d'immunocytochimie à l'aide de divers marqueurs (phalloïdine-rhodamine, anticorps anti-actine, etc.) ont montré à chaque fois une colocalisation importante de la calponine avec l'actine et notamment avec des structures filamentaires telles que les filaments fin des cellules musculaires lisses ou les fibres de stress des fibroblastes ou des astrocytes. L'observation en microscopie électronique, in vitro, montre que la localisation de la calponine apparaît de façon périodique le long des filaments d'actine préalablement purifiés. La calponine peut également induire la fasciculation des filaments d'actine in vitro (Kolakowski et al.,1995 ; Tang & Janmey, 1996). La longueur de la calponine permet de recouvrir 3 molécules d'actine le long du filament. A faible concentration, soit une calponine pour trois monomères d'actine, les filaments d'actine restent dissociés ; à plus forte concentration, soit une calponine pour une actine, les filaments d'actine fasciculent et forment des " bundles " rappelant les fibres de stress (Kolakowski et al., 1998). Ces données laissent également supposer qu'il existe deux sites de fixation à l'actine. De surcroît, la calponine permet également à forte concentration et à faible concentration ionique, de faciliter la polymérisation de l'actine (Kake et al., 1995 ; Kolakowski et al, 1995) et d'empêcher sa dépolymérisation, contribuant ainsi, comme le font les tropomyosines et les caldesmones, à la stabilisation des filaments d'actine. L'ensemble de ces données a permis de caractériser la calponine comme une protéine faisant partie intégrante des microfilaments.

2. 4. 1. 3 Inhibition de l'activité ATPasique de l'actomyosine

Dans certaines conditions in vitro, la calponine basique peut inhiber les mouvements des filaments d'actine qui sont associés au développement de la force produite par l'activité ATPasique (activée par l'actine filamentaire) de la myosine. En présence d'un système actomyosine activé et fonctionnel (myosine phosphorylée par la MLCK, abondance d'ATP, etc.) la calponine inhibe directement l'activité ATPasique de l'actomyosine et ce d'une façon dose-dépendante (Winder & Walsh, 1990 ; Shirinsky et al., 1992 ; Haeberle, 1994). Cet effet inhibiteur peut être renversé en présence de protéines liant le calcium telles que la calmoduline, la caltropine ou la protéine S100 (fig. 9). Le degré d'inhibition de la calponine sur l'activité actomyosine est assez variable, allant de 25 à 90% de la Vm (Abe et al., 1990 ; Nishida et al., 1990 ; Horiuchi & Chacko, 1991). Ces résultats peuvent en partie être expliqués par le fait que les concentrations de CP/actine variaient de 0,1 à 0,6 dans les différents travaux publiés (soit une calponine pour dix actine à trois calponine pour cinq actine). Ainsi, en tenant compte de la teneur en calponine dans les muscles lisses (1CP/7 actine), l'inhibition de cette dernière sur le système actomyosine ne pourrait être supérieure à 30%, sauf si la calponine était concentrée uniquement dans les zones ou se trouve la myosine (domaines contractiles), ce qui n'est pas le cas.

En plus de cette propriété inhibitrice de l'actomyosine, la calponine interagit également avec la myosine ; cette interaction ne se fait pas au niveau de la sous unité S1 mais plutôt directement avec la sous unité S2 et avec la HMM (Szymanski et al, 1993 ; 1997). Ainsi, la fixation de la calponine sur la myosine pourrait stimuler, ou activer comme l'actine-F, l'activité ATPasique de la myosine (Lin et al., 1993), cet effet n'étant pas affecté par la calcium-calmoduline. En tenant compte de ces données, l'inhibition de l'activité ATPasique de l'acto-S1 par la calponine ne peut impliquer un simple mécanisme d'encombrement stérique entre l'actine et la tête S1 de la myosine (Miki et al., 1992). Néanmoins, la calponine peut induire un changement conformationnel de l'actine. Un mécanisme probable d'inhibition serait que la calponine fixée à l'actine réduise sa capacité d'activer l'ATPase de la myosine. Ainsi, les résultats sur la cinétique enzymatique montrant une réduction de la Vm sans affecter le Km vont dans ce sens. Un article récent, utilisant une titration différentielle de l'actine, de la sous unité S1 et de la calponine, montre que l'inhibition de l'activité actomyosine par la calponine se fait sans déplacer la sous unité S1 de son site de fixation à l'actine suggérant l'existence de deux sites de fixation de la calponine sur l'actine. Ce ménage à trois permet d'envisager un mécanisme d'inhibition où la calponine interagirait avec l'actine et la myosine simultanément. Ce mécanisme d'inhibition est, comme nous venons de le voir, complètement différent de celui de la caldesmone ou de la troponine. La calponine serait aussi un facteur déterminant dans le " latch state " (état bloqué) de la contraction.

2. 4. 1. 4 Isoformes et variants génétiques

Tout comme les différentes isoformes d'actine, on distingue plusieurs types de calponines suivant leur point isoélectrique (pI), d'où leur nom ; Il y a ainsi trois isoformes principales (fig. 13) : ce sont les calponines basiques (8,7 <pI< 9,9), les calponines neutres (7,1 <pI< 8,3) et les calponines acides (pI = 5,2-5,4). Ces différentes isoformes ont été clonées et séquencées (fig. 15) à partir de trois gènes différents chez plusieurs espèces (Takahashi & Nadal-Ginard, 1991 ; Nishida et al., 1993 ; Strasser et al., 1993 ; Applegate et al., 1994 ; Maguchi et al., 1995 ; Masuda et al., 1996 ; Ferhat et al., 1996 ; Gao et al., 1996 ; Miano et al., 1997). Ceci permet de définir l'ensemble des calponines caractérisées jusqu'à présent : il existe ainsi des formes dites " lourdes " ou bien de " hauts poids moléculaire h " (high molecular weight) comprenant les calponines basiques aviaires alpha (poulet et dinde) et les calponines basiques mammaliennes h1 (rat, souris, bœuf, porc et homme), les calponines neutres mammaliennes h2 et les calponines acides mammaliennes h3. Enfin, il existe des isoformes marginales, peu nombreuses, dites " légères " ou bien de " faible poids moléculaire l " (low molecular weight) obtenues par épissage alternatif, ce sont les formes aviaires bêta (Takahashi & Nadal-Ginard, 1991) et mammaliennes l (Draeger et al., 1991).

Ces isoformes possèdent également de fortes homologies avec de nombreuses autres protéines (fig. 16 et 17). Parmi ces protéines, il y a la protéine de 22 kDa du muscle lisse SM22 (Pearlstone et al., 1987), la protéine de 20 kDa des muscles de la drosophile MP20 (Ayme-Southgate et al., 1989), la protéine de 87 kDa du gène unc-87 de Caenorhabditis Elegans UNC87 (Goetinck et al., 1994), la protéine neuronale de 25 kDa NP25 (Ren et al., 1994), la myophiline, une protéine de 21,2 kDa présente chez Echinococcus granulosus (Martin et al., 1995), une protéine sénescente surexprimée dans le syndrome de Werner (Werner Syndrome) WS 3-10 (Thweatt et al., 1992) et une protéine isolée chez la souris, la mp27. Enfin, la calponine possède aussi une certaine homologie de séquence avec les protéines possédant le domaine d'homologie à la calponine CH (" Calponin Homology "). Parmi ces protéines, certaines interagissent avec l'actine, citons Vav, IQ GAP 1 et 2, l'alpha-actinine, la spectrine, la filamine, et la fimbrine.

2. 4. 2 Calponine acide (h3). (revenir à 2. Données bibliographiques)

2. 4. 2. 1 Généralité (fonctions ; localisation)

Après avoir isolé en 1986 une nouvelle protéine p34K (protéine de 34 kilodalton), nommée par la suite calponine, à partir du gésier de poulet, Takahashi et al. publiaient en 1987 un deuxième article sur la présence de la p34K dans les muscles lisses bovins. En utilisant un anticorps polyclonal fabriqué à partir de la p34K de gésier de poulet, ils mirent également en évidence une protéine immunoréactive de 36 kDa présente dans les tissus non-musculaires lisses. Les tissus analysés par immunoblotting étaient du cortex cérébral, de la membrane intestinale, du ventricule et de l'atrium de cœur ainsi que de la medulla et du cortex de glandes surrénales. De nombreuses publications, entre temps, montraient que la calponine était une protéine basique de 34 kDa spécifiquement exprimée par les muscles lisses de toutes les espèces étudiées jusqu'alors et qui présentait les caractéristiques de se fixer sur les filaments d'actine et d'inhiber l'activité ATPasique de l'actomyosine in vitro. En 1991, Takeuchi et al. reconnaissaient des protéines " calponine-immunoréactives " de 37 et 23 kDa dans des plaquettes et des cellules musculaires lisses de vaisseaux sanguins de bœuf, ainsi que dans des fibroblastes de souris. Ces formes immunoréactives colocalisaient fortement en culture cellulaire avec l'actine le long des fibres de stress et au niveau du cortex cellulaire. Néanmoins, la forme de 23 kDa aurait représenté la protéine SM22 qui possédant une forte homologie avec la calponine pouvait réagir de façon croisée avec l'anticorps (Takahashi & Nadal-Ginard, 1991). L'identité de la forme de 36-37kDa restait cependant floue jusqu'en 1994 où Applegate et al. publiaient un article qui justifiait l'existence d'une isoforme acide, non musculaire, de 36,4 kDa et qui présentait une homologie de séquence avec les autres formes de calponine.

N'ayant été ainsi que récemment découverte, il existe très peu de données sur la calponine acide. Clonée pour la première fois chez le rat par Diane Applegate et collaborateurs en 1994 puis chez l'homme par Motofumi Maguchi et collaborateurs en 1995 , elle possède environ 70% d'homologie avec les autres isoformes de calponine (fig. 15 et fig. 16). Le messager code pour un polypeptide de 330 aminoacides. Lorsque l'on analyse sa séquence, on peut la subdiviser en plusieurs domaines (fig. 18) : Dans la région N-terminale, également appelée région " calponine ", on retrouve les trois domaines communs avec les autres isoformes de calponine. Il y a le domaine Calponin Homology (CH), le site de fixation à l'actine (Actin Binding Site ou ABS), et trois séquences répétées (calponin tandem repeats ou CTR). Dans la région C-terminale, c'est là que se situe le domaine acide spécifique de la protéine (acidic domain ou AD). Le poids moléculaire déduit à partir de la séquence est de 36,377 kDa et son point isoélectrique de 5,2, lui conférant ainsi son caractère fortement acide en comparaison avec les autres isoformes précédemment décrites. Néanmoins, c'est le domaine acide C-term. (57 résidus enrichis en glutamate, aspartate, tyrosine et proline) qui rend la protéine très acide (pI déduit calculé = 3,7) car le domaine calponine N-term. (le reste de la protéine, c.a.d. les 273 aminoacides restant) reste très fortement basique (pI déduit calculé = 8,9). Le domaine acide présente un motif structural nouveau que nous appellerons " EY " car il est caractérisé par 5 paires de résidus aminoacides glutamate E (ou aspartate D) -tyrosyl Y espacées périodiquement (DYQAEYPDEYHGEYPDEYPKEYQY). Le domaine acide et en particulier le motif EY possèdent une très forte homologie de séquence (93,3%) avec une seule séquence connue dès lors et précédemment clonée à partir d'hippocampes cérébraux humains par Adams et al. en 1992, il s'agit d'une séquence partielle baptisée HUMXT01244. Ces données suggèrent fortement que cette séquence partielle soit un fragment d'une isoforme acide de la calponine humaine et que cette isoforme soit présente dans le cerveau humain. Alors que la calponine avait été décrite comme spécifique des muscles lisse (Gimona et al., 1990) la séquence clonée chez le rat par Applegate représente alors une isoforme non-musculaire. Ceci s'est confirmé par la suite lorsque M. Maguchi et collaborateurs, puis L. Ferhat et collaborateurs, ont cloné respectivement la calponine acide chez l'homme et à partir du cerveau de rat (Maguchi et al., 1995, Ferhat et al., 1996).

Les analyses d'Applegate et al. par northern blot quant à la distribution du messager CP acide dans différents tissus révèlent que l'expression de la calponine acide est la plus forte dans les reins, la rate, le cerveau et l'estomac, puis à un niveau plus faible dans l'aorte, le cœur et les intestins suggérant ainsi que la calponine acide est exprimée aussi bien dans les tissus musculaires que dans les tissus non-musculaires. De surcroît, ils ont montré que la calponine acide interagissait avec l'actine mais pas avec la Ca2+-calmoduline (Applegate et al., 1994).

Enfin, un article récent traitant de l'implication des différentes régions de la calponine dans son interaction avec l'actine a montré que des cellules transfectées avec un vecteur codant pour la calponine acide exprimaient cette protéine et que sa localisation coïncidait avec les fibres de stress (Gimona et al, 1998).

2. 4. 2. 2 Calponine acide et système nerveux

L'ensemble des données préacquises par Takahashi et al., en 1987, Takeuchi et al. en 1991 et par Applegate et al. en 1994, ainsi que l'initiative d'Elisabeth der Terrossian dans le laboratoire de l'unité 29 de l'INSERM nous amenait à entreprendre l'identification et la caractérisation d'une forme acide de la calponine dans le système nerveux central (Trabelsi-Terzidis et al.,1995 et Ferhat et al., 1996).

Ces résultats permettent de prouver que la calponine acide est présente dans le système nerveux central, et ce aussi bien dans les neurones que dans l'astroglie mais ne précisent pas la localisation de cette protéine. La calponine acide est-elle présente le long des filaments d'actine neuronaux et colocalise-t-elle avec la myosine ? Quelles sont les sous-types cellulaires et les domaines subcellulaires impliqués ? La calponine est-elle présente dans les cônes de croissance, les épines dendritiques, etc. ? Quelles différences peut-on observer lors de période de très grande plasticité telle que pendant le développement ou après lésion ?

2. 5 Relation, similarités et différences entre la caldesmone et la calponine (revenir à 2. Données bibliographiques)

Il est intéressant de noter que la plupart des tissus tels que les muscles lisses et certains tissus non-musculaires comme le tissu nerveux contiennent à la fois la caldesmone et la calponine ou tout du moins une de leurs isoformes. Certains points communs entre ces deux protéines sont saisissant et méritent que l'on s'y attarde. Il s'agit de leurs capacités à se fixer sur les filaments d'actine et de faire partie intégrante des microfilaments au même titre que les tropomyosines ; d'ailleurs la forme allongée de ces trois protéines est caractéristique. Leur structure et leur composition chimique permettent ainsi une grande résistance à la chaleur et à l'acidité du milieu. Une de leur fonction première serait de protéger le filament d'actine de la fragmentation, de la dépolymérisation et de la protéolyse. Il y a aussi la propriété d'inhiber in vitro l'activité ATPasique de l'actomyosine. Il est par conséquent inévitable de se poser la question : pourquoi deux protéines régulatrices du système moteur basé sur l'actine existent-elles et sont requises dans les mêmes cellules ? Il est à noter que d'autres protéines ont été caractérisées comme pouvant également se fixer sur l'actine et inhiber l'activité actomyosine (cofiline : Nishida et al., 1984 ; fodrine : Wagner, 1984 ; protein 4.1 : Pasternack & Racussen, 1989 ; drebrine : Hayashi et al., 1996).

Néanmoins, il existe des dissimilitudes particulières entre ces deux protéines suggérant qu'elles aient des fonctions et des modes d'action différents. Parmi ces différences, citons en premier lieu le fait que la taille et la séquence de leurs gènes respectifs diffèrent grandement. Celui de la caldesmone comprenant d'ailleurs de nombreux introns (=> épissage).

Lorsque ces protéines sont incubées avec l'actine-F dans des conditions saturantes, la caldesmone et la calponine entrent en compétition pour se fixer sur le filament d'actine ; la calponine est alors plus efficace et déplace la caldesmone (Makuch et al., 1991). Ce résultat sous-entend que ces deux protéines ne forment pas un complexe uni et mutuel mais sont au contraire séparées et forment deux populations distinctes le long des microfilaments. L'interaction entre la caldesmone et la calponine est d'ailleurs un sujet contreversé, certains affirmant que l'interaction entre ces deux protéines est forte (Graceffa et al., 1996), d'autre soutenant qu'elle est trop faible et voire impossible physiologiquement (Czurylo et al., 1997). En plus, les sites de fixation sur l'actine sont strictement différents, la caldesmone se fixe sur l'extrémité N-terminale de l'actine et la calponine sur l'extrémité C-terminale (Miki et al., 1992 ; Mezgueldi et al., 1992). La localisation de ces protéines est intéressante car la caldesmone est restreinte aux domaines ou appareils contractiles, confirmant un rôle dans la contraction cellulaire alors que la calponine est située à la fois dans les régions contractiles et dans les régions cytosquelettiques ou on retrouve les microfilaments, les filaments intermédiaires de desmine mais pas de myosine, suggérant un rôle plus ambigu. Nous avons également vu que l'influence de la caldesmone sur l'activité actomyosine est induite et modulée par la tropomyosine, alors que l'inhibition de la calponine est indépendante de la tropomyosine. De surcroît, un mécanisme de régulation différent par les " calcium-binding " protéines ou par les kinases est envisageable. Bref, ces nombreux arguments tendent à soutenir le fait que ces deux protéines ont des fonctions relativement différentes dans les cellules.

 

Objectifs du présent travail

Comme nous l'avons montré dans les chapitres précédents, la plupart des connaissances sur les protéines microfilamentaires provient des études effectuées sur les systèmes musculaires. Bien que les microfilaments occupent une place importante dans la physiologie des cellules nerveuses, relativement peu de choses sont connues sur l'expression, la localisation et le rôle de ces protéines dans le système nerveux. L'objectif de cette thèse est d'étudier dans le SNC trois de ces protéines microfilamentaires : l'isoforme bêta de l'actine, l'isoforme non-musculaire de la caldesmone (la L-caldesmone) et l'isoforme non-musculaire de la calponine (la calponine acide). Afin de réaliser et d'approfondir cette étude morphologique, nous avons choisi d'utiliser plusieurs approches expérimentales. Différents types de microscopies associées aux techniques histologiques et immunocytochimiques ont été ainsi employées. Notre travail, initié en 1993-94, a d'abord permis de montrer les différents types cellulaires in vivo et ex vivo exprimant ces isoformes chez l'adulte et de préciser leur localisation au cours du développement. Nous avons étudié si ces protéines colocalisaient entre elles, avec la myosine, le long des microfilaments ainsi qu'avec d'autre protéines du cytosquelette, comme les filaments intermédiaires (vimentine, GFAP, neurofilaments) et les microtubules (a-tubuline, bIII-tubuline, MAP-2). Enfin, nous avons aussi analysé les changements de leur expression au cours de la plasticité réactive en utilisant un modèle d'épilepsie du lobe temporal particulièrement bien connu : l'injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique.

Nos travaux, ceux de Ulloa & Avilla (1996), de Weinberger et al. (1996) puis de Bassel et al. (1998) et de Micheva et al. (1998) , ont permis de mieux préciser la localisation et la distribution de l'actine bêta dans le SNC. Bien que certains articles avaient déjà montré la présence de la caldesmone dans les cônes de croissance de neurones en culture (Sobue, 1993 ; Kira et al., 1995) et dans l'astroglie, le long des fibres de stress (Abd-el-Basset et al., 1991), rien était connu sur la distribution régionale et cellulaire de la protéine in vivo. Finalement, l'état des connaisances actuelles sur l'expression, la distribution et la localisation de la calponine dans le cerveau est le fruit des travaux effectués dans notre laboratoire. Hélène Trabelsi-Terzidis et collaborateurs montraient notamment qu'une isoforme acide de la calponine était présente dans les cerveaux de porc et de rat (Trabelsi-Terzidis et al., 1995) et Lotfi Ferhat et collaborateurs clonaient la calponine acide à partir du cerveau de rat et de cellules nerveuses et gliale (Ferhat et al., 1996).

Dans la prochaine partie de cette thèse, nous allons donc résumer les principales données acquises lors de ce travail sur ces trois protéines microfilamentaires dans le SNC et préciser leur distribution et leur localisation pendant le développement postnatal et après lésion à l'acide kaïnique.

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