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3. Résultats

3. 1 Actine bêta

3. 1. 1 Enrichissement de l'actine bêta dans la microglie.

3. 1. 2 Distribution de l'actine bêta pendant le développement.

3. 1. 3 Distribution de l'actine bêta après lésion à l'acide kaïnique.

3. 2 L-caldesmone

3. 2. 1 Présence et distribution de la L-caldesmone dans le SNC adulte.

3. 2. 2 Distribution de la L-caldesmone pendant le développement

3. 2. 3 Distribution de la L-caldesmone après lésion à l'acide kaïnique

3. 3 Calponine acide

3. 3. 1 Présence et distribution de la calponine acide dans le SNC adulte.

3. 3. 2 Expression et distribution de la calponine pendant le développement.

3. 3. 3 Distribution de la calponine après lésion à l'acide kaïnique

 

3. 1 Actine bêta (revenir à 3. résultats)

L'ensemble des manipulations d'immunohistochimie décrites dans ce chapitre a été réalisé en utilisant un anticorps monoclonal de souris (clone AC-15 de chez Sigma) reconnaissant spécifiquement la partie N-terminale de l'actine bêta (cf. introduction fig. 7 et Gimona et al., 1994). Ces manipulations se sont faites sur des coupes flottantes de cerveau de rat d'environ 40 mm d'épaisseur.

Voir Figure 10 pour la spécificité des anticorps

3. 1. 1 Enrichissement de l'actine bêta dans la microglie. (revenir à 3. résultats)

L'immunoréactivité de l'actine bêta est relativement faible dans le système nerveux central adulte. Sa distribution concerne toutes les régions du cerveau (télencéphale, diencéphale, mésencéphale et cervelet). Néanmoins, certaines régions, telle que l'hippocampe (fig 3a), sont beaucoup plus marquées que d'autres. La substance blanche, c'est à dire le corps calleux, la fimbria, les commissures antérieures et postérieures, les capsules internes et externes, les voies du striatum et du cervelet, ne sont pas marqués ; cependant, certaines cellules gliales présentes entre les faisceaux d'axones sont immunoréactives. En accord avec les travaux de Weinberger et al. (1996), on constate que l'actine bêta est ainsi absente des axones matures. Seuls les compartiments somatodendritiques des cellules nerveuses sont immunoréactifs. Néanmoins, au niveau des corps cellulaires, l'immunoréactivité est très faible, et seul un fin marquage sousmembranaire est observable. Les cellules qui apparaissent les plus marquées sont les cellules microgliales (fig. 1a). Elles sont aisément reconnaissables par leur morphologie. Ce sont des cellules de petite taille comprenant de nombreuses extensions hautement ramifiées et crénelées rappelant l'aspect de la dentelle. La distribution de l'actine bêta dans ces cellules est relativement homogène et semble concerner toutes les cellules microgliales (fig. 1c). L'immunoréactivité est alors présente à la fois dans le corps cellulaire et dans les prolongements ; le noyau des cellules n'est pas marqué (fig. 1a). Cet enrichissement de l'actine bêta dans la microglie contraste fortement avec les autres types cellulaires (neurones, astrocytes et oligodendrocytes) et pourrait dans certains cas être utilisé en tant que marqueur microgliale dans le système nerveux adulte (fig. 1a et 1c).

 

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3. 1. 2 Distribution de l'actine bêta pendant le développement. (revenir à 3. résultats)

L'analyse que nous avons faite de l'immunoréactivité de l'actine bêta pendant le développement s'est restreinte aux cerveaux des nouveau-nés (de P0 à P21). D'une manière générale, l'immunoréactivité de l'actine bêta est beaucoup plus intense à la naissance (P0) que chez l'adulte (P>60). Les cellules les plus immunoréactives sont des cellules larges, sphériques, de type amiboïde ; la majorité de ces cellules est dépourvue de prolongements. Elles sont groupées le long des commissures (fig. 1d,e et 2a,c) et autour des vaisseaux sanguins (fig. 1b). Au fur et à mesure du développement postnatal, ces cellules présentent différents types de morphologies, passant d'une forme ronde à une forme ramifiée (fig. 1d,e et 2a,b). Dans le cervelet, la distribution de ces cellules se restreint essentiellement au niveau de la substance blanche et dans les zones les plus périphériques entre la pie et la couche granulaire externe (fig 2c). Ces cellules sont OX-42 positives (marqueur des cellules microgliales). L'ensemble de ces données nous a donc permis de caractériser ces cellules comme étant de la microglie-macrophage. Le pattern d'immunoréactivité retrace parfaitement l'invasion du cerveau par les cellules macrophagiques provenant de la circulation sanguine, se dispersant dans tout le cerveau et empruntant les voies privilégiées que sont les faisceaux d'axones (substance blanche).

L'immunoréactivité de l'actine bêta est également présente dans les couches de la neuropile à tous les stades du développement postnatal. Elle est la plus intense à la naissance puis décroît fortement jusqu'à l'âge adulte (fig. 1c,d,e). Par exemple, à P4, la couche granulaire externe prémigratoire (ou postmitotique), la couche granulaire interne et la couche moléculaire du cervelet sont bien marquées (fig. 2c,d). A l'inverse, la couche granulaire externe germinative cgeg (ou proliférative) est très faiblement marquée (fig. 2c). Dans les cellules de Purkinje l'immunoréactivité se trouve confinée tout autour du soma ; l'actine bêta est alors concentrée au niveau du cortex cellulaire, sous la membrane plasmique (fig. 2d) . Dès la naissance, les voies axonales sont spécialement enrichies en microglie-macrophages et ces cellules sont très marquées (fig. 1d,e ; fig. 2) ; il nous est donc très difficile de dire si les axones sont immunoréactifs à ce stade du développement (P0-P4). Néanmoins, il a été montré que l'isoforme bêta de l'actine était présente dans les axones immatures (E17) de la moelle épinière et disparaissait des axones matures (Weinberger et al, 1996). De plus, l'actine b est essentiellement enrichie dans les extrémités terminales des neurites, dans les cônes de croissance et sous la membrane plasmique des cellules nerveuses en culture (Ulloa & Avila, 1996).

 

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3. 1. 3 Distribution de l'actine bêta après lésion à l'acide kaïnique. (revenir à 3. résultats)

Nous avons montré que l'actine bêta était enrichie dans l'hippocampe (fig. 3a) et notamment au niveau de la microglie-macrophage (fig. 1a et 3b) et ce à tous les stades du développement postnatal (fig. 1 et 2). Afin de préciser la localisation de cette protéine dans la plasticité réactive et dans le but de voir si l'immunoréactivité de l'actine bêta était associée à la réaction microgliale, nous avons utilisé un modèle de lésion relativement bien connu : l'injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique (se référer à l'introduction fig. 2, chapitre 1. 2. 3). Cette injection se caractérise entre autre par des remaniements importants dans l'amygdale et dans l'hippocampe lorsque l'animal traité au KA fait des crises modérées n'entraînant pas la mort. Dans ce cas, on peut observer une mort neuronale, une réaction gliale, incluant à la fois une prolifération astrogliale et microgliale, et un bourgeonnement des fibres moussues de l'hippocampe (Represa et al., 1995).

Les rats traités au KA et présentant des crises convulsives ont été sacrifiés à différents intervalles de temps après l'injection (de 6h à 30j après KA). Dans tous les cas, on observe que l'immunoréactivité de l'actine bêta est fortement augmentée dans les premiers jours qui suivent l'injection au niveau de l'amygdale (non montré), dans l'hippocampe ipsilatéral (fig. 3c), essentiellement dans la région CA3 mais également dans la région CA1, et dans le subiculum. Dans certains cas, suivant l'intensité des crises, on peut voir aussi une augmentation dans l'hippocampe contralatéral, dans le cortex entorhinal adjacent à l'hippocampe ipsilatéral et dans quelques noyaux thalamiques (ex : noyau ventropostérieur parvocellulaire).

L'analyse des types cellulaires exprimant l'actine bêta montre que l'augmentation de l'immunoréactivité concerne uniquement la microglie-macrophage. La morphologie des cellules les plus immunoréactives est représentée dans la figure 3d. Ces cellules sont pratiquement dépourvues de prolongements. L'immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre un marqueur de la microglie activée, ED1, ou avec un marqueur astroglial, la GFAP, confirme que les cellules les plus marquées par les anticorps anti-actine bêta ne sont pas des astrocytes mais bien des cellules de type macrophages-microglie (fig. 4). Néanmoins, ces résultats ne permettent en aucun cas de dire si l'augmentation de l'immunoréactivité de l'actine bêta est due à la prolifération des cellules microgliales, à l'invasion des macrophages sanguins ou à une augmentation de synthèse de la protéine ; ou peut être, ce qui est fort probable à chacun des trois phénomènes. Ce que l'on peut dire, c'est qu'après lésions épileptiques, il existe une corrélation entre l'augmentation de l'immunoréactivité de l'actine bêta et la réaction microgliale. Trente jours après l'injection d'acide kaïnique, le nombre de cellules microgliales marquées dans l'hippocampe (et en particulier dans CA3) a diminué (fig. 3e) mais reste supérieur en densité par rapport au contrôle (fig. 3a). La région et les cellules immunoréactives semblent moins intensément marquées et la morphologie de ces cellules est différente (fig. 3f) ; par exemple, elles sont munies de prolongements et de ramifications mais ceux-ci sont moins longs et plus nombreux que chez les cellules microgliales des rats contrôle (fig. 3a). L'ensemble de ces données suggère que l'actine bêta puisse jouer un rôle déterminant dans les changements morphologiques impliqués lors de la réaction microgliale (Gonflement des prolongements, diminution des ramifications, rétraction et disparition des prolongements, division cellulaire, réacquisition des prolongements, etc.). Enfin, nous n'avons pas observé de modifications particulières de l'immunoréactivité dans les régions de bourgeonnement des fibres moussues de l'hippocampe (i.e., tiers inférieur de la couche moléculaire du gyrus denté), ce qui n'exclue pas pour autant que cette isoforme de l'actine puisse être impliquée dans la croissance neuritique, le guidage des cônes de croissance et la néosynaptogénèse, mais ceci n'a pu être mis en évidence par les techniques présentement utilisées.

 

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3. 2 L-caldesmone (revenir à 3. résultats)

Les différents anticorps anti-caldesmone utilisés dans cette étude n'ont pas été directement fabriqués à partir de la L-caldesmone de cerveau de rat mais à partir de la L-caldesmone de plaquette de porc (Der Terrossian et al., 1989). Néanmoins, la spécificité de ces anticorps a été testée par immunobloting sur des homogénats de cerveau de rat (fig. 10a, ligne 2 et 3). Après migration des protéines sur SDS-PAGE, les anticorps révèle une simple bande correspondant à une protéine d'environ 80 kDa. L'ensemble des manipulations d'immunohistochimie décrites dans ce chapitre a été réalisé sur des coupes flottantes de cerveau de rat d'environ 40mm d'épaisseur.

Voir Figure 10 pour la spécificité des anticorps

3. 2. 1 Présence et distribution de la L-caldesmone dans le SNC adulte. (revenir à 3. résultats)

L'immunoréactivité de la caldesmone est relativement faible in vivo chez l'adulte (fig. 5). Les anticorps anti-CD de plaquette marquent néanmoins certaines cellules du SNC et préférentiellement le corps cellulaires des neurones. Les cellules les plus intensément marquées sont les cellules pyramidales du cortex (fig. 5a,b) et les cellules pyramidales de la région CA3a de l'hippocampe (fig. 5d), les interneurones de l'hippocampe (fig. 6a), les cellules de Purkinje du cervelet (fig. 6b et fig. 8e) et certains neurones thalamiques (fig. 5c,e). L'aspect du marquage est ponctiforme dans les corps cellulaires et le long des dendrites. La substance blanche et les axones ne sont pas immunoréactifs. Quant aux cellules gliales, bien que la présence et la localisation de la caldesmone ait été démontré dans des cultures d'astrocytes (non montré ; Abd-el-Basset et al., 1991) aucun marquage in vivo n'a pu être mis en évidence dans ces cellules. De même, la L-caldesmone est également présente dans les neurones en culture (non montré ; Kira et al., 1995).

Lorsque l'on compare l'immunoréactivité de la L-caldesmone avec celle de l'actine (fig. 6a,b), de MAP-2 (non montré) ou de la tubuline alpha (non montré), on constate que ces protéines sont présentes dans les mêmes compartiments somatodendritiques. Néanmoins, de nombreuses cellules et compartiments subcellulaires comportant de l'actine et de la tubuline sont dépourvus de caldesmone. L'immunoréactivité de la caldesmone semble être confiné dans la périphérie cellulaire au niveau du cortex cellulaire sous la membrane plasmique (fig. 5e).

 

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microscopie électronique

Le marquage ponctiforme de la L-caldesmone pourrait correspondre à une localisation au niveau de certaines régions privilégiées telles que les synapses. L'immunoréactivité des cellules pyramidales du néocortex laisse également suggérer un marquage dans les épines dendritiques. Cependant, dans le cas d'un enrichissement de la L-caldesmone au niveau des synapses, ces données ne permettent pas de préciser si la protéine se trouve du côté présynaptique, du côté postsynaptique ou des deux côtés à la fois. Afin de répondre à cette question et de préciser sa localisation dans les cellules nerveuses, nous avons observé la distribution de la caldesmone à un niveau ultra structural en microscopie électronique (fig. 7).

L'analyse des données obtenues en microscopie électronique permet d'affirmer que la L-caldesmone est particulièrement enrichie dans les épines dendritiques et dans les densités postsynaptiques (fig. 7b et 7c). Aucun marquage des éléments présynaptiques et des axones n'a été détecté ; ceci est particulièrement bien visible au niveau des terminaisons synaptiques (caractérisées par de nombreuses vésicules ; fig. 7b) et au niveau des axones myélinisés (fig. 7d). Ces données montrent que la L-caldesmone ne peut être impliquée dans la régulation de la libération des neurotransmetteurs, bien que ceci aurait pu être envisageable (voir p56). Les régions sousmembranaires sont également fortement immunopositives. De plus, il apparaît que tous les dendrites ne sont pas marqués (fig. 7a), et dans le cas où ils le sont, l'immunoréactivité est souvent présente le long des microtubules (fig. 7c). Enfin, les cellules gliales ne sont pas marquées (fig. 7d).

 

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3. 2. 2 Distribution de la L-caldesmone pendant le développement. (revenir à 3. résultats)

Après avoir montré que la L-caldesmone était présente exclusivement dans les régions somatodendritiques des neurones matures et particulièrement enrichie dans les épines dendritiques et les densités postsynaptiques, et sachant qu'elle avait été préalablement identifiée dans les cônes de croissance des cellules nerveuses en cultures (Kira et al., 1995), nous avons donc étudié sa localisation dans le cerveau pendant le développement postnatal chez le rat (de P0 à P21 et chez l'adulte). A première vue, comme pour l'actine bêta, on constate que l'immunoréactivité de la caldesmone est beaucoup plus forte à la naissance que chez l'adulte. Dans le cervelet (fig. 8), structure privilégiée pour notre étude car ayant une maturation postnatale, la caldesmone est particulièrement enrichie dans la couche des cellules de Purkinje et dans la couche granulaire interne des ratons âgés de 4 jours (fig. 8a). La couche moléculaire et la couche granulaire externe apparaissent très peu marquées. La couche granulaire externe est divisée en deux zones : une zone germinative (la plus externe) et une zone prémigratoire (située entre la zone germinative et la couche moléculaire). Les cellules granulaires sont générées dans la zone germinative et prolifèrent activement avant de devenir postmitotiques puis de migrer vers la couche granulaire interne à travers la couche moléculaire. La zone germinative n'est pas marquée alors que la couche granulaire externe prémigratoire et la couche moléculaire sont légèrement immunoréactive (fig 8a). L'ensemble de ces données suggère par conséquent que la caldesmone ne serait présente que dans les neurones post-mitotiques en voie de différenciation. Enfin, progressivement, l'immunoréactivité de la L-caldesmone décroît dans le cervelet (fig. 8 b,c et d) jusqu'à l'âge adulte (fig. 8 e) où elle se restreint essentiellement dans le corps cellulaire des cellules de Purkinje, bien qu'un léger marquage ponctiforme persiste au niveau de la couche moléculaire et de la couche granulaire. Dans tous les cas, les voies axonales (substance blanche, fibres parallèles, etc.) ne sont pas significativement marquées. Dans l'hippocampe immature (fig. 9a), l'immunoréactivité est plus intense dans la couche des cellules pyramidales, dans la couche des grains et dans les interneurones mais sa distribution ne diffère guère de celle de l'adulte. Cette modulation de l'intensité du marquage dans le cervelet et l'hippocampe suggère, entre autre, que la L-caldesmone puisse jouer un rôle important dans la plasticité développementale.

 

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3. 2. 3 Distribution de la L-caldesmone après lésion à l'acide kaïnique. (revenir à 3. résultats)

Nous avons également étudié la localisation de la caldesmone après injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique. Dans ce modèle de plasticité réactionnelle, les neurones de la couche granulaire de l'hippocampe ont tendance à bourgeonner et à former de nombreuses branches collatérales se développant au niveau du hilus et du tiers inférieur de la couche moléculaire du gyrus denté. L'analyse faite chez les rats traités au kaïnate montre que l'immunoréactivité de la caldesmone augmente dans les cellules pyramidales de CA3 dès 24h après KA (non montré), puis disparaît dans les régions sclérosées (amygdale, hippocampe) où les cellules nerveuses ont péri et s'intensifie au contraire dans ces mêmes régions où les cellules nerveuses ont subsisté sept jours après KA (fig. 9c). Néanmoins aucune modification importante n'a pu être mis en évidence dans les régions de bourgeonnement des fibres moussues. La couche granulaire reste pauvrement immunoréactive bien que dans certains cas le marquage semble être plus important chez les rats traités au KA (fig. 9c) que chez les rats contrôles (fig. 9b). Ces données suggèrent que la L-caldesmone n'intervient pas dans les mécanismes essentiels qui sont impliqués dans le bourgeonnement des fibres moussues. Cependant, au même titre que pour l'actine bêta, en sachant que ces deux protéines sont enrichies dans les extrémités croissantes des neurites, il est possible que la L-caldesmone puisse jouer un rôle discret mais important dans ces remaniements, ce qui ne peut pas être révélé par immunohistochimie. Il est à noter qu'aucun marquage dans les cellules gliales réactives (astroglie et microglie) n'a été décelé.

 

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3. 3 Calponine acide (revenir à 3. résultats)

Trois anticorps différents, dirigés contre la calponine, ont été utilisés lors de cette étude : il s'agit de deux anticorps anti-CP basique de gésier (dont un anticorps monoclonal de souris, clone CP-93 de chez Sigma et un anticorps polyclonal GCp92 de lapin, cf. Mezgueldi et al., 1992) et d'un anticorps anti-CP acide de rat (anticorps polyclonal RCpF3 de lapin) reconnaissant les 16 résidus aminoacides couvrant la séquence E311-Q326 de la partie C-terminale de la protéine. La spécificité de ces anticorps a été testée par immunoblotting à partir d'homogénats de cerveau de rat. Sur les gels monodimensionnels, ces trois anticorps reconnaissent une même et seule bande d'environ 36 kDa correspondant au poids moléculaire de la calponine acide (fig. 10a, ligne 4 et fig. 10b, ligne 6). L'anticorps polyclonal F3 anti-CP acide ne réagit pas avec un isolât de calponine basique de gésier purifiée montrant ainsi sa spécificité de réaction vis à vis de l'isoforme acide de la calponine (fig. 10b, ligne 5).

Voir Figure 10 pour la spécificité des anticorps

3. 3. 1 Présence et distribution de la calponine acide dans le SNC adulte. (revenir à 3. résultats)

L'analyse de la distribution de l'immunoréactivité de ces différents anticorps dans l'encéphale adulte montre quelques différences notables. Les anticorps anti-CP basique présentent une immunoréactivité restreinte et peu intense. Ces anticorps anti-CP basique marquent exclusivement certaines cellules nerveuses (fig. 11a,c et e) avec un marquage ponctiforme très similaire à celui de la caldesmone (fig. 5) alors que l'anticorps spécifiquement dirigé contre la forme acide marque à la fois les cellules nerveuses et les cellules astrogliales dans toutes les régions du SNC (fig. 11b et d ; figs. 15c, 16c et f, et 18g ; fig. 25a et b). Les gros vaisseaux sanguins, les cellules du plexus choroïde et les cellules épendymaires sont aussi marqués (non montré), tandis que la substance blanche et les différentes voies axonales ne sont pas marquées par les différents anticorps anti-calponine utilisés (ceci est illustré fig. 16c dans le cervelet adulte). L'immunoréactivité de l'anticorps anti-CP acide est diffuse et semble être présente dans tous les types cellulaires, néanmoins parmi les cellules clairement identifiées, ce sont les cellules du plexus choroïde, les cellules de la glie de Bergmann du cervelet, les cellules de la glie radiale du gyrus denté, de nombreux astrocytes, et certaines cellules nerveuses comme les cellules pyramidales qui sont les mieux marquées.

 

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L'analyse du marquage en comparaison avec la localisation de différentes protéines du cytosquelette telle que l'actine (fig. 12a), la caldesmone (fig. 12b) et la myosine (fig. 12c) montre que la calponine est présente dans les mêmes champs et les mêmes domaines cellulaires. Toutefois, les régions riches en actine et en myosine ne sont pas saturées et montrent une distribution plus large que celle de la calponine (fig. 12a,c). A l'inverse, l'immunoréactivité de la caldesmone apparaît plutôt adjacente et non superposable à celle de la calponine dans les mêmes compartiments subcellulaires (fig. 12b). De surcroît, certaines régions sont beaucoup plus enrichies en calponine qu'en caldesmone. Parmi ces régions, citons par exemple les couches moléculaires et granulaires du cervelet (fig. 8e/fig. 16f).

 

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microscopie électronique

De même que pour la caldesmone, nous avons examiné la localisation de la calponine acide au niveau ultrastructural ; le but étant de préciser sa localisation in vivo dans les cellules nerveuses et les cellules gliales. L'observation en microscopie électronique révèle que la calponine acide est présente, de façon exclusive, dans les régions postsynaptiques des cellules nerveuses (corps cellulaire et dendrites) et tout particulièrement dans les épines dendritiques et dans les densités postsynaptiques (fig. 13a,b,c). Les axones et les terminaisons axonales ne sont jamais marquées (fig. 13 a et c). Ces données montrent que la calponine, tout comme la caldesmone, ne peut être impliquée dans la libération des neurotransmetteurs. Nous avons remarqué aussi que les régions sousmembramaires sont souvent très immunoréactives (densités postsynaptiques, membrane plasmique, membrane externe de certaines mitochondries). Ces résultats sur la localisation de la calponine acide dans les neurones montrent une profonde similitude avec ceux de la caldesmone. Seule différence, les cellules astrogliales (i.e. astrocytes protoplasmiques) sont très bien marquées au niveau ultrastructural par les anticorps anti-calponine (fig. 13d) mais ne le sont jamais avec les anticorps anti-caldesmone utilisés (fig. 7d). Cependant tous les astrocytes ne sont pas calponine immunopositifs (fig. 13d), et lorsqu'ils le sont, le marquage est souvent associé à la membrane plasmique le long des prolongements.

 

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3. 3. 2 Expression et distribution de la calponine pendant le développement. (revenir à 3. résultats)

Cette étude s'est restreinte au développement postnatal de l'encéphale. Cependant, l'expression et la localisation de la calponine acide a été plus approfondie que dans le cas de l'actine bêta et de la L-caldesmone. Ces résultats sont présentés en trois partie. La première partie décrit l'analyse biochimique et révèle l'expression différentielle des isoformes de la calponine acide pendant le développement postnatal du cervelet et de l'hippocampe (3.3.2.1). La deuxième partie décrit la distribution immunohistochimique de la protéine dans les différentes régions du SNC immature (3.3.2.2). Et la troisième partie montre sa localisation dans les cellules nerveuses et gliales en culture à plusieurs stades de différenciation (3.3.2.3).

3. 3. 2. 1 Expression de la calponine acide pendant le développement postnatal de l'encéphale

Des immunoblots réalisés sur des gels d'électrophorèse en deux dimensions nous ont permis de détecter plusieurs isoformes de la calponine acide exprimées par le cerveau et de montrer que ces isoformes étaient régulées dans l'hippocampe et le cervelet de façon spatio-temporelle en nombre et en quantité. Les niveaux relatifs de ces différentes isoformes sont diminués de façon significative entre P0 et l'âge adulte (fig. 14) ; à P0 la quantité de calponine détéctée sur 125 mg de protéines totales est plus importante que chez l'adulte ou pour obtenir un résultat similaire il faut au moins 260 mg de protéines totales. De surcroît, l'isoforme la plus acide disparaît de façon définitive à P10 dans l'hippocampe ou de façon transitoire dans le cervelet P10. Ces résultats nous permettent également de montrer que chaque structure n'exprime pas le même nombre d'isoformes pendant le développement (i.e. 3 à 4 pour l'hippocampe et 2 à 3 pour le cervelet) et que chaque isoforme (chacune décrite par un spot plus ou moins gros sur le gel) a un taux d'expression différent par rapport aux autres isoformes au sein d'une même structure. Dans chaque cas, c'est l'isoforme la plus acide qui est la plus faiblement exprimée. De plus, Lotfi Ferhat et collaborateurs n'ont isolé qu'un seul type d'ARN messager dans les cerveaux de rat adulte ou en développement. Par conséquent, les différentes isoformes détectées devraient correspondre probablement à des modifications post-traductionelles de la protéine. Enfin, nous n'avons pas décelé d'isoforme de plus bas ou de plus haut poids moléculaire.

 

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3. 3. 2. 2 Distribution de la calponine acide pendant le développement

L'analyse de l'immunoréactivité de la calponine acide pendant le développement postnatal du cerveau montre que la protéine est très largement distribuée dans de nombreuses régions dés la naissance. Néanmoins, le pattern d'immunoréactivité évolue différemment suivant les structures cérébrales considérées. Ainsi, nous allons décrire la distribution de la calponine acide dans trois larges régions qui sont relativement bien marquées (le cortex fronto-parietal, le cervelet et l'hippocampe) et ce à trois stades significatifs du développement postnatal (P4, P10 et chez l'adulte).

Immunoréactivité de la calponine acide pendant le développement postnatal du néocortex : Dans le cortex fronto-pariétal des rats âgés de 4 jours (P4), la calponine acide est particulièrement enrichie dans la glie radiaire et dans les gros vaisseaux sanguins (fig. 15a). La glie limitans est également marquée. Entre P7 et P10, de nombreux astrocytes apparaissent fortement marqués dans les différentes couches corticales (fig. 15b). Ceci correspond à la période pendant laquelle la glie radiaire se transforme en astrocytes. La calponine acide est absente des cellules nerveuses du néocortex à la naissance et à P4 mais progressivement apparaît puis augmente dans les dendrites à partir de P10 jusqu'à l'âge adulte (fig. 15 a, b et c). Les corps cellulaires des cellules nerveuses sont peu marqués, néanmoins un fin marquage sousmembranaire est observable (fig. 15c).

 

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Immunoréactivité de la calponine acide pendant le développement postnatal du cervelet : Dans le cervelet immature des jeunes rats (P4 et P10), la calponine acide est très enrichie dans la glie de Bergmann et dans les vaisseaux sanguins (fig. 16a,d). Cependant, à la différence des régions télencéphaliques (néocortex et hippocampe), un marquage neuronal est déjà visible dans les couches granulaires internes et externes et ce dés la naissance (fig. 16a,d). Les fibres parallèles et les corps cellulaires des cellules granulaires apparaissent marqués en contraste avec les cellules de Purkinje (fig. 16a,d). Entre P10 et l'âge adulte, l'immunoréactivité de la calponine décroît globalement dans le cervelet et tout particulièrement dans les couches granulaires mais augmente légèrement de façon diffuse dans la couche moléculaire et dans les cellules de Purkinje (fig. 16b,c,e et f). La glie de Bergmann est encore clairement immunoréactive et de nombreux astrocytes sont fortement marqués dans la substance blanche (fig. 16c).

 

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Immunoréactivité de la calponine acide pendant le développement postnatal de l'hippocampe : Dans la formation hippocampique, l'immunoréactivité de la calponine acide est très similaire à celle du cortex, où les cellules astrogliales (glie radiaire, glie limitans et astrocytes) sont les plus intensément marquées dès les premier jours qui suivent la naissance. Nous avons ainsi comparé la distribution de la calponine acide avec des marqueurs astrogliaux bien connus sur des coupes adjacentes. Il s'agit de la vimentine (qui marque essentiellement la glie radiaire) et de la GFAP (qui marque les astrocytes matures). A P4, les patterns d'immunoréactivité de la calponine acide et de la vimentine sont pratiquement identiques (fig. 17 a, b) tandis que l'immunoréactivité de la GFAP se restreint autour de la fissure hippocampique, de la fimbria et du corps calleux (fig. 17c). A P10, la calponine acide montre une distribution plus étendue au sein de l'hippocampe, reflétant une présence à la fois dans les astrocytes et dans les neurones (fig. 17d). Les couches de la neuropile sont intensément marquées mais la couche des corps cellulaires est très faiblement marquée. En comparaison, la distribution de la vimentine reste la même mais l'intensité de son immunoréactivité chute considérablement (fig. 17e), tandis que l'immunoréactivité de la GFAP augmente et apparaît dans de nombreux astrocytes essentiellement dans la région CA3 (fig. 17f).

 

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Colocalisation de la calponine acide avec différents marqueurs neuronaux et gliaux pendant le développement postnatal :

Afin de confirmer que la calponine acide était bien présente dans les cellules nerveuses et les cellules gliales en développement et dans le but de préciser sa localisation, nous avons réalisé des doubles marquages en immunofluorescence avec différents marqueurs tels que la vimentine et la GFAP (voir ci-dessus), la bêta III tubuline et MAP-2 (composant des microtubules et marqueurs de différenciation neuronale) et la parvalbumine (protéine liant le calcium qui est considérée comme un marqueur relativement spécifique des cellules de Purkinje du cervelet).

La vimentine colocalise fortement avec la calponine acide dans la glie radiale du cortex et de l'hippocampe ainsi que dans la glie de Bergmann du cervelet dès les premier jour du développement postnatal (P0-P10). Cette colocalisation est illustrée à P4 dans les fibres de la glie de Bergmann et dans des prolongements gliaux présent autour des cellules de Purkinje (fig. 18a). La GFAP colocalise aussi avec la calponine acide dans la glie radiale, la glie limitans et les astrocytes. Cependant, la GFAP n'apparaissant que de façon tardive dans ces cellules astrogliales, cette colocalisation n'a pu être observée indubitablement qu'à partir de P10 dans la glie de Bergmann du cervelet (fig. 18b) et plus rarement dans la glie radiale du cortex et de l'hippocampe. Chez l'adulte, la glie de Bergmann et la glie radiale du gyrus denté de l'hippocampe ainsi que de nombreux astrocytes sont doublement marqués (fig. 18g).

 

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Les doubles marquages réalisés avec la bêta III tubuline et MAP-2 montrent que la calponine acide est présente dans les neurones (fig. 18 d,e et f). A titre d'exemple, la calponine acide colocalise avec la bêta III tubuline dans des éléments neuronaux du striatum à P10 mais semble absente des faisceaux d'axones qui sont à l'inverse très bien marqués avec l'anticorps anti-bêta III tubuline (fig. 18d). La colocalisation de la calponine avec MAP-2 est également évidente dix jours après la naissance dans les dendrites des cellules granulaires internes et des cellules de Purkinje du cervelet (fig. 18e) et dans les troncs dendritiques des cellules pyramidales du néocortex (fig. 18f). En vue de préciser l'apparition de la calponine acide dans les cellules de Purkinje, nous avons comparé l'immunoréactivité de la calponine avec celle de la parvalbumine. A P4, aucune colocalisation n'est observée (non montré). A P10, de nombreux corps cellulaires des cellules de Purkinje sont doublement marqués et quelques axones sont également immunoréactifs (fig. 19a). A P14, la calponine acide et la parvalbumine colocalisent dans les domaines somatodendritiques (fig. 18c). Chez l'adulte, la calponine acide et la parvalbumine colocalisent essentiellement au niveau de la couche moléculaire (dendrites des cellules de Purkinje). Nous avons également réalisé des doubles marquages avec l'actine bêta montrant une colocalisation importante mais pas totale entre les deux protéines dans les domaines somatodendritiques. Ceci est illustré dans le gyrus denté de l'hippocampe 10 jours après la naissance (fig. 19b).

 

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3. 3. 2. 3 Localisation de la calponine acide dans les cellules du cervelet, du cortex et de l'hippocampe en culture.

La présence de la calponine acide dans les cellules nerveuses et gliales en développement nous a amené à étudier sa localisation dans les cellules en culture à différents stades de maturation cellulaire. Plusieurs types de cultures ont été réalisés (culture mixte du cervelet P2-P4, culture de neurones du cortex E16 et culture d'astrocytes d'hippocampe P2). Afin d'observer les différentes caractéristiques morphologiques de ces cellules en croissance, nous avons utilisé une densité cellulaire relativement faible et nous avons fixé les cellules à des temps variés après l'ensemencement. Nous avons attaché plus d'importance à montrer la localisation de la calponine dans les extrémités croissantes et les régions de grande motilité. Nous avons également observé la distribution de la calponine dans les autres types cellulaires présents dans ces cultures tels que les fibroblastes et la microglie.

Les différentes cellules ont été identifiées par des critères morphologiques mais également par des doubles marquages avec des marqueurs cellulaires tels que MAP-2 (non montré), la bêta III tubuline (non montré), les neurofilaments NF-L et NF-H (non montré), la vimentine (fig. 21h et 22d) et la GFAP (fig. 21f et 22g). Dans tous les cas, les cellules cultivées sont très bien marquées par les anticorps polyclonaux anti-calponine utilisés (l'anti-CP basique GCp92 et l'anti-CP acide RCpF3). D'une manière générale, l'immunoréactivité est la plus intense à la périphérie des cellules.

Dans les cellules nerveuses, l'immunoréactivité de la calponine acide est présente à tous les stades de la différenciation neuronale et montre un enrichissement important dans les cônes de croissance et dans le soma (fig. 20). Les prolongements neuritiques sont à l'inverse très faiblement marqués. Il est à noter que le pattern d'immunoréactivité dans les cellules granulaires du cervelet est très similaire à celui des neurones corticaux (fig. 20 a et b). Des comarquages avec la phalloïdine-rhodamine ont été réalisé afin de comparer la localisation de la calponine acide avec l'actine filamentaire (fig. 20 c-f). La calponine acide colocalise très bien avec l'actine-F dans le cœur des cônes de croissance, mais de nombreux filopodes fortement marqués par la phalloïdine-rhodamine sont dépourvus de calponine (fig. 20 c-f). Dans le cas où la calponine acide est présente dans les filopodes, l'immunoréactivité de calponine acide est absente de leur extrémité.

 

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Dans les cellules astrogliales, la calponine acide est également présente à tous les stades de différenciation (fig. 21 et 22). Dans les cellules immatures, non confluentes, l'immunoréactivité est surtout concentrée dans le cortex cellulaire sous la membrane plasmique et le long des fibres de stress (fig. 21 et 22). Les cônes de croissance (fig. 21a), les prolongements gliaux (fig. 21e) et les corps cellulaires (fig. 21g) sont également bien marqués. La calponine acide colocalise fortement avec l'actine-F dans ces mêmes régions (fig. 21a-d et 22a,b), bien que la distribution de l'actine-F soit plus étendue notamment dans les régions motiles et les extrémités protrusives telles que les filopodes (fig. 21b,d). Les expériences de double marquage avec des anticorps monoclonaux dirigés contre la GFAP (fig. 21f) ou contre la vimentine (fig. 21h) montrent que la calponine acide est également présente le long des extensions et des prolongements immatures dans les régions et domaines où se trouvent les gliofilaments. Cette colocalisation est particulièrement frappante dans le cas de la vimentine (fig. 21g,h).

Dans les cultures cellulaires d'hippocampe P2 enrichies en astrocytes matures et portées à confluence, la localisation de la calponine acide ne diffère pas ou peu de celle observée dans les cellules astrogliales immatures du cervelet, néanmoins aucune colocalisation avec les gliofilaments de GFAP ou de vimentine n'a pu être observée dans les astrocytes matures (fig. 22). De plus, nous avons également remarqué que certaines cellules qui sont GFAP+ et vimentine+ ne contenaient pas de calponine (fig. 22 c-f). Ces cellules astrogliales dépourvues de calponine acide sont en générale petites et comportent des prolongements très fins.

 

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Parmi les autres types cellulaires présents dans les cultures mixtes de cervelet et qui sont également marqués par l'anticorps anti-calponine acide RCpF3, nous avons identifié des cellules microgliales, des macrophages et des cellules fibroblastiques. Dans les cellules microgliales, la calponine acide se concentre dans le corps cellulaire ; les fins prolongements ramifiés qui caractérisent ces cellules sont très bien marqués par la phalloïdine (fig. 23b) mais ne sont pas marqués par l'anticorps anti-CP acide (fig. 23a) ce qui montre que l'actine filamentaire qui est présente dans les extensions microgliales est dépourvu de calponine. Dans les fibroblastes, la calponine acide est présente essentiellement le long des fibres de stress (fig. 23 c et e) où elle colocalise très bien avec l'actine-F (fig. 23 d et f) bien que certains filaments d'actine soient dépourvus de calponine. Dans tous les cas, aucune immunoréactivité dans le noyau des cellules n'a été décelée.

 

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3. 3. 3 Distribution de la calponine après lésion à l'acide kaïnique. (revenir à 3. résultats)

Comme pour l'actine bêta et la L-caldesmone, nous avons examiné si la calponine acide pouvait être associée à la plasticité réactionnelle induite après injection intra-amygdalienne d'acide kaïnique. Nous avons pour cela analysé la distribution de l'immunoréactivité de la protéine chez des rats traités au KA et sacrifiés à différent intervalles de temps de 6h à 30j après l'injection. Les différents anticorps dirigés contre la calponine ont été utilisés : il s'agit des anticorps anti-CP basique (Ref : Sigma CP-93 et Mezgueldi et al., 1992) dont nous avons vu qu'ils reconnaissaient uniquement les cellules nerveuses in vivo et de l'anticorps anti-CP acide F3 qui reconnait à la fois les neurones et les astrocytes.

L'analyse faite chez les rats traités au KA montre que l'immunoréactivité de ces différents anticorps augmente très fortement dans l'amygdale (non montré) et dans le hilus et la région CA3 de l'hippocampe ipsilatéral dés les premiers jours qui suivent l'injection (fig. 24 et 25). Cependant, alors que l'immunoréactivité des anticorps anti-calponine basique augmente dans les interneurones et les cellules pyramidales (fig. 24), l'immunoréactivité de l'anticorps anti-calponine acide est très étroitement associée à la réaction gliale (fig. 25). On constate également que l'évolution de l'immunoréactivité de l'anticorps anti-CP basique est tout à fait comparable à celle de l'anticorps anti-caldesmone. L'augmentation de l'immunoréactivité a lieu dès 6h après KA (non montré), atteint un maximum autour de 24h après KA (fig. 24b), puis diminue en même temps que la dégénérescence des cellules pyramidales de CA3 (fig. 24d) et disparaît définitivement en trois à sept jours après KA dans les régions sclérosées où les cellules nerveuses ont péri (fig. 24e). De temps en temps, l'immunoréactivité reste encore relativement intense dans certaines cellules nerveuses qui ont subsisté (non montré). Il est possible que l'augmentation observée avec l'anticorps anti-CP basique dans les cellules nerveuses de CA3 ne puisse être détectée avec l'anticorps anti-CP acide et/ou soit masqué par la réaction astrogliale. En tout cas, les doubles marquages réalisés avec la GFAP (marqueur des astrocytes) montrent une colocalisation très nette avec la calponine acide dans les astrocytes réactifs (fig. 26). Cependant, tous les astrocytes réactifs ne sont pas intensément marqués par l'anticorps anti-CP acide ; ainsi, les astrocytes hypertrophiés de la couche moléculaire du gyrus denté ne le sont pas. Ceci nous a permis de distinguer au moins trois populations astrogliales différentes dans l'hippocampe ipsilatéral des rats traités au KA : les astrocytes du hilus et de CA3 (qui sont GFAP+++/ CP+++), les astrocytes de la couche moléculaire du gyrus denté (qui sont GFAP+++/CP+) et les astrocytes des autres couches de l'hippocampe (qui sont GFAP+/CP+).

Aucune modification importante de l'immunoréactivité n'a pu être mis en évidence dans les régions de bourgeonnement des fibres moussues bien qu'un léger marquage apparaisse au niveau du tiers inférieur de la couche moléculaire du gyrus denté chez les rats traités au KA entre 12 et 20 jours après injection (fig. 25c,e). De part sa présence dans les extrémités croissantes (voir ch. 3.3.2.3), il est possible que la calponine acide joue un rôle dans le guidage des cônes de croissance et dans la néosynaptogénèse des branches collatérales bourgeonnantes des fibres moussues.

 

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